Application Note 遠赤色蛍光を用いた細胞内活性酸素種の測定

イントロダクション

ホアン・ハー｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

活性酸素種（ROS）は、好気性細胞代謝によって生じる酸素を封じ込めた化学的に反応性の分子です。これらの化学種は、細胞シグナリング、恒常性維持、免疫防御などの細胞プロセスに関与している。しかし、環境ストレス下では、細胞内の活性酸素レベルが劇的に上昇し、脂質、タンパク質、核酸に酸化的損傷を引き起こす可能性がある1。このような変化は、男性不妊症、発がん、その他多くの生理学的状態など、さまざまな病的事象に関連している2。

細胞内活性酸素レベルの測定には、蛍光プローブが一般的に使用されており、中でも緑色蛍光プローブが最も普及している。しかし、緑色蛍光領域での検出とイメージャーは、細胞内自家蛍光の影響を受ける可能性があります3。代わりに、遠赤外および近赤外（NIR）蛍光色素を使用することで、細胞内自家蛍光の干渉を避けて活性酸素レベルを測定することができます。

SpectraMax® iD5 マルチモードマイクロプレートリーダーの特許取得済み過冷却PMTおよび4モノクロメーター光路設計により、シグナルのバックグラウンドと迷光を低減します。これらの特性により、遠赤色蛍光アッセイに広いダイナミックレンジと感度が得られます。

ここでは、SpectraMax iD5リーダーを使用して、2種類の蛍光測定アッセイキットを用いて細胞内活性酸素レベルを測定する方法を示す。Spectral Optimization Wizardを用いて、遠赤アッセイ用の励起および発光波長の組み合わせを最適化した。最後に、緑色蛍光アッセイと遠赤色蛍光アッセイのアッセイ性能を比較した。

材料

• セルメーター™ 蛍光細胞内総ROS活性アッセイキット*深赤色蛍光* (AAT Bioquest社製 cat. #22903)
• セルメーター™ 蛍光細胞内総 ROS 活性測定キット * 緑色蛍光* (AAT Bioquest 社製 cat. #22900)
• HEK293細胞 (AATC cat. #CRL-1573)
• メナジオン (Sigma cat. #M9429-25G)
• 96ウェル組織培養処理黒壁透明底96ウェルプレート (Greiner cat. #655087)
• SpectraMax iD5 マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices cat.）

方法

HEK293細胞を96ウェル細胞培養処理マイクロプレートに1ウェル当たり10,000個プレーティングし、37℃のインキュベーターで24時間細胞を回復させた。その後、細胞を25μMから始まる2倍希釈系列のメナジオンで1時間処理した。処理後、Cell Meter Deep Red ROS検出試薬またはCell Meter Green Fluorescence ROS検出試薬のいずれかを細胞に添加し、プレートを37℃で30分間インキュベートした。

セルメーターDeep Red ROSアッセイの推奨波長ペア（658/675）は、励起波長と発光波長が近接しているため、SpectraMax iD5リーダーとの相性が悪かった。この実験では、625/700波長ペアを見積もり、励起と発光モノクロメーターの帯域幅の間に十分な距離があり、なおかつ十分な蛍光シグナルが得られるようにした（図1）。

図1. 遠赤色蛍光スペクトル。セルメーター ディープレッド活性酸素アッセイの励起および Emission スペクトルを上に示す。赤の点線は 650 nm にピークを持つ励起スペクトルを、赤の実線は 675 nm にピークを持つ Emission スペクトルを表す。グレーのバーは、アッセイに使用した最適化されていない波長ペアと、それらに関連するモノクロメーターのバンド幅15 nm（励起）と25 nm（発光）を表しています。

SoftMax® ProソフトウェアのSpectral Optimization Wizardを使用して、遠赤アッセイに最適な励起およびEmission波長ペアを自動的に計算した。さらに、"Read Height Optimization "設定を使用して、アッセイに最適なリードハイトを決定した。実験に使用した Wavelength と PMT gain を Table 1 に示す。データとグラフはSoftMax Proソフトウェアを用いて作成した。

表1. アッセイの波長とPMTの設定。

結果

メナジオンは、ミトコンドリアの電子輸送連鎖の様々な部位を阻害す ることにより、細胞内に活性酸素を蓄積させる4 。従って、メ ナジオン濃度が上昇すると、細胞内の活性酸素レベルが上昇す ることが予想された。緑色蛍光アッセイキットと遠赤色蛍光アッセイキットの両方が、同様のEC50値を持つメナジオン用量反応曲線を作成した（図2および3）。Spectral Optimization Wizardの遠赤アッセイ用 Wavelengthsの組み合わせは、最良のZ'ファクターを提供した（表2）。

図2. 緑色蛍光による細胞内活性酸素測定。メナジオン処理HEK293細胞をCell Meter Green Fluorescence細胞内活性酸素アッセイを用いてアッセイし、SoftMax Proソフトウェアで4パラメータ用量反応曲線を作成した。データから1.86μMのEC50が算出された。

図3. 遠赤色蛍光による細胞内活性酸素の測定。Spectral Optimization Wizardで決定された波長ペア（水色）は、userestimated波長ペアと比較してより大きなアッセイウィンドウを生成した。EC50値は2.10 µMと2.21 µMで、それぞれスペクトル最適化波長ペアとユーザー推定波長ペアから算出された。

表2. セルメーター遠赤アッセイの用量反応と Z 因子の表。各アッセイから算出されたEC50値は類似しており、各アッセイともZファクターは0.5を大きく上回り、ロバスト性を示している。

結論

SpectraMax iD5 マルチモードマイクロプレートリーダーは、SoftMax Proソフトウェアと組み合わせることで、細胞内の活性酸素レベルをフルオロメトリーで測定できる優れたツールです。SoftMax ProソフトウェアのSpectral Optimization Wizardおよびリードハイト最適化機能は、最良の結果が得られるようにアッセイ条件を自動的に最適化します。SpectraMax iD5リーダーは両方のアッセイを効果的に検出できたが、励起およびEmission波長を最適化した遠赤アッセイは、緑色蛍光ベースのアッセイよりもZ'ファクターがわずかに優れていた。

参考文献

1. Hancock, J. T., R. Desikan, and S. J. Neill. 「細胞シグナリング経路における活性酸素種の役割。「Biochem Soc Trans. (2001) May; 29 (Pt 2)： 345-50
2. 小川和彦、鈴木和彦、奥津正明、山崎一郎、新海信哉。好中球からの活性酸素種レベルの上昇と高齢者における低悪性度炎症との関連。Immunity & Ageing： 2008; 5:13. doi: 10.1186/1742-4933-5-13.
3. Lin, Michael Z. "Beyond the rainbow: new fluorescent proteins brighten the infrared scene. "Nature Methods 8.9 (2011)： 726.
4. Kolesova, G. M., L. V. Karnaukhova, and L. S. Iaguzhinskiĭ. 「DTジアホラーゼ機能におけるQサイクルとメナジオンおよびデュロキノンの相互作用。「Biokhimiia (Moscow, Russia) 56.10 (1991)： 1779-1786.