GPCR（Gタンパク質共役受容体） 細胞外物質を認識し、細胞膜を介してシグナルを伝達
GPCR（Gタンパク質共役受容体）とは
GPCRまたはGタンパク質共役型受容体は細胞表面に存在するタンパク質です。細胞外物質を認識し、細胞膜を介してシグナルを伝達します。GPCRは細胞内でシグナル伝達を担うグアニンヌクレオチド結合タンパク質（Gタンパク質）を活性化することでこれを実行します。シグナル伝達は、細胞成長、遺伝子転写、翻訳後変化、他の細胞とのコミュニケーションなど、様々な細胞反応において非常に重要です。例えば、身の危険を感じると心拍数が増加したり、薄暗い光に反応して視力が変化したりすることもあります。
ヒトゲノム研究だけでも、ホルモン、脂質、アミン、神経伝達物質、光などを検出する少なくとも1000種類のGPCRが存在します。
GPCRは3つの領域で構成されています。細胞外部分はリガンドを検出し結合します。次に7つの膜貫通領域が構造変化を起こします。最後に、この変化によってC末端が活性化され、対応するGタンパク質が作動します。
Gタンパク質共役受容体とイオンチャネル
GPCRは600から1000のメンバーからなる最大のタンパク質ファミリーであり、多くの正常な生物学的状態と病的状態に関連しています。GPCRは7回膜貫通型（7-TM）受容体としても知られ、現代の医薬品の約45％はこの標的クラスに作用します。GPCRの機能は非常に多様であり、光子、低分子、タンパク質など幅広いリガンドを認識します。
イオンチャネルは細胞膜にある孔で、イオンの出入りを可能にします。ヒトゲノム上に存在するイオンチャンネル遺伝子は、400以上あります。その多くは、現在ブロックバスターとなっている医薬品の標的です。イオンチャネル活性の直接測定は、パッチクランプ用の伝統的な電気生理学装置を用いて行われますが、スループットは非常に低くなります。イオンチャネル活性は、膜電位、カルシウムフラックス、カリウムフラックスの変化に敏感な蛍光色素を用いることにより、間接的に、はるかにハイスループットで測定することもできます。
創薬のためのGPCR活性モニター
GPCR活性の変化は細胞内シグナル伝達経路の異常を引き起こし、炎症、心血管系疾患、精神障害、ホルモンバランスの乱れ、癌などを引き起こします。そのため、GPCRは創薬の中心的存在であり、FDA承認薬の約34%は明確に定義された108種類のGPCRを標的としています。
GPCR活性とそれに対応する細胞内変化をモニターするために、創薬では様々なアッセイを用いることができます。
カルシウムはGPCR活性によって生まれる重要なメッセンジャーです。そのため細胞内カルシウムシグナルの変化は、GPCRの活性化状態を示す強力な指標となります。カルシウム流動アッセイは、薬剤スクリーニングにおける細胞内カルシウムレベルのモニタリングに用いることができます。
カルシウムオシレーションのモニタリングは、薬剤候補のin vitro毒性を予測するためにも極めて重要です。
環状アデノシン一リン酸（cAMP）は、シグナル伝達経路に関与するもう一つの重要なメッセンジャーです。細胞内cAMPレベルの変化は特異性GPCR-Gタンパク質結合を示します。cAMPアッセイは、GPCRサブタイプに関する貴重な情報を与えます。
リガンド結合時のGPCR脱感作に主眼を置いたトランスフルオアッセイでGPCR活性をモニターすることも可能です。これらのアッセイは、GPCRの活性化／非活性化や細胞膜を横切る動きをモニターするために、薬剤スクリーニングに導入することができます。
GPCR（Gタンパク質共役受容体）を支援する製品・サービス
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FLIPR Penta
ハイスループットセルベーススクリーニングシステム
リード化合物の同定および化合物の安全性評価を目的とした
ハイスループットカイネティックスクリーニングに理想的なシステム -
SpectraMax iD3/iD5
マルチモードマイクロプレートリーダー
大型タッチスクリーンを備えた高感度マイクロプレートリーダー
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ImageXpress Micro 4
ハイコンテント イメージングシステム
設定可能なハイスループットのワイドフィールドイメージングソリューション
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ImageXpress Micro Confocal
ハイコンテントイメージングシステム
1週間に100万ウェルを超えるイメージングが可能な、ユニークな共焦点イメージングソリューション
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FlexStation 3
マルチモードマイクロプレートリーダー
イオンチャネル・GPCR活性の測定に威力を発揮する
自動マルチチャンネルピペッター搭載マルチマイクロプレートリーダー -
SpectraMax i3x
マルチモードマイクロプレートリーダー
研究ニーズに合わせて進化できるマイクロプレートリーダー
GPCRに対する早期リードを特定するためのソリューション
当社は、GPCRおよびイオンチャネルの機能研究をサポートするために、アッセイキット、セルラースクリーニングおよびイメージングシステム、マイクロプレートリーダーなど、さまざまなアッセイおよびインストゥルメンテーションソリューションを提供しています。
ここでは、FLIPRハイスループット細胞スクリーニングシステム、Screenworks Peak Pro 2ソフトウェアモジュール、各種FLIPRアッセイキットを使用したアプリケーションに焦点を当て、毒性学およびリード化合物同定のためのハイスループットカイネティックスクリーニングソリューションを提供します。
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心筋細胞
薬剤による機能的心毒性の早期予測には、ハイスループットスクリーニングに適したロバスト性のin vitroシステムが必要である。入手しやすいiPSC由来のヒト心筋細胞をカルシウム感受性色素と併用することで、GPCRとイオンチャネルの両方に反応する細胞内カルシウムの変化として拍動速度とパターンをモニターすることができます。これらのカルシウムピークは、心筋細胞活性を定量化するための強力なツール群を提供する当社のScreenWorks Peak Pro 2ソフトウェアで解析することができます。
Cor.4UヒトiPSC心筋細胞におけるカルシウム過渡に対する化合物の効果 >
幹細胞由来心筋細胞を用いたハイスループット心毒性アッセイ > -
心毒性：カルシウム
オシレーション
人工多能性幹細胞（iPSC）由来の心筋細胞は、心機能と安全性の両方に対する化合物の影響を評価するために使用されるため、特に魅力的なin vitroモデル系である。カルシウムシグナルのオシレーションは細胞質カルシウム濃度の変化を反映するため、EarlyTox™心毒性キットのようなカルシウム感受性色素を使用することが可能です。
FLIPR TetraシステムによるiCell心筋細胞2のカルシウムオシレーション測定 >
ヒトiPSC由来心筋細胞における化合物誘発性催不整脈作用のマルチパラメトリック評価 > -
カルシウムフラックスの評価
カルシウムフラックスの評価は、長い間受け入れられてきた、試行錯誤の末に確立された細胞活性の尺度である。カルシウムフラックスは、神経伝達物質放出、GPCR活性、リガンドゲートイオンチャネル、心筋細胞の拍動パターンなど、多くの細胞プロセスの測定に使用できます。FLIPR Pentaシステムは、その使いやすさ、感度、ユーザー設定可能性から、ハイスループットおよび超ハイスループット・スクリーニングにおけるカルシウムフラックス評価のための創薬ツールです。
FLIPRカルシウム6アッセイキットでカルシウムスクリーニングを強化 >
新規カルシウム測定法と蛍光ベースのカルシウム流動アッセイとの比較 > -
Fura-2 QBTカルシウム
Fura-2色素は、細胞イメージング、GPCRを介した細胞内カルシウムフラックス、イオンチャネルの活性化におけるカルシウム動員を測定するための重要なツールと考えられてきました。このレシオメトリック色素は、結合インジケーターと遊離インジケーターの蛍光強度比を計算することにより、色素のローディングやセルプレーティングにおけるアッセイの不一致を補正するのに役立ちます。しかし、洗浄が必要であるため、ウェル間のばらつきが大きくなり、各アッセイに時間と複雑さが加わります。 モレキュラデバイス社のFura-2 QBT™ カルシウムキットは、実績のあるクエンチベースのテクノロジーとレシオメトリックFura-2カルシウムインジケータを組み込んだもので、検出前の細胞洗浄を省くことでスループットを向上させながら、細胞ベースのばらつきを最小限に抑える均一性アッセイを提供します。
Fura-2 QBT カルシウムキット： ホモジニアスFura-2カルシウム測定キット >
FLIPR TetraシステムまたはFLEXstation 3リーダー用Fura-2 QBTレシオメトリックカルシウムキット > -
GPCRアッセイ用
ホモジニアス溶液
細胞ベースアッセイは、初期の創薬プロセスにおけるスクリーニングや化合物プロファイリングに不可欠な手法となっています。今日まで、このようなアッセイは、受容体の特性評価研究、一次スクリーニング・キャンペーン、化合物プロファイリング・プログラムにおいて、最も信頼性が高く、再現性の高い方法の一つであることが証明されています。特にGq共役型GPCRターゲットに対しては、マスキング技術を用いた均一性蛍光カルシウム流動アッセイが選択される方法です。
新規の蛍光色素と実績のあるマスキング技術を組み合わせたFLIPRカルシウム5アッセイキットは、信頼性の高い薬理作用、より広いシグナルウィンドウ、アッセイ性能の向上を実現します。FLIPRカルシウム5アッセイキットとFLIPRシステムにより、様々なレセプターやターゲット、特にカルシウムシグナル応答が小さいレセプターの一貫したスクリーニングを、使いやすい均一性フォーマットで行うことができます。
FLIPRカルシウム5アッセイキットによるGPCRアッセイ用ホモジニアス溶液 > -
ライブセルGi-およびGs共役GPCRセカンドメッセンジャーシグナリング
GiおよびGs共役型GPCRセカンドメッセンジャーシグナル活性の検出は、従来、放射性結合アッセイやエンドポイントcAMPアッセイなど、細胞溶解を必要とするアッセイを用いて行われてきました。このようなアッセイ法は、細胞応答における単一の時点における活性を測定するものであり、カイネティックな情報は得られません。もう一つの方法は、GiおよびGs共役型GPCRをGα16に強制結合させ、アゴニスト受容体の活性化に伴うカルシウムフラックスを蛍光検出する方法です。このアッセイもまた、生体関連cAMP経路を介さないため、最適とは言えません。
ここでは、FLIPR システムを用いて、GloSensor™ プラスミドを安定発現させた CHO-K1 および HEK-293 細胞株における内因性受容体活性を実証します。
FLIPRテトラシステムによるライブ細胞Gi-およびGs-共役GPCRセカンドメッセンジャーシグナル伝達 > -
ライブセルカイネティック
アッセイ
ImageXpressコンフォーカルおよびマイクロ4ハイコンテントイメージングシステムは、オプションのフルイディクスおよび環境制御モジュールを提供し、迅速なカイネティクスまたは長時間のタイムラプス実験中の化合物添加および培地交換のためのシングルチャンネルピペッティングを可能にします。Transfluor細胞ベースGPCRアッセイキットは、ハイコンテントスクリーニング（HCS）中に使用される貴重なツールで、GFP標識β-アレスチンを用いてGPCRの脱感作とリサイクリングを定量化し、自動画像解析することにより、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）の活性化を追跡します。
ImageXpressマイクロシステムを用いたライブセルカイネティクスアッセイ > -
細胞内カルシウムフラックス
の測定
Gタンパク質共役型受容体（GPCR）は細胞シグナリングにおいて重要な役割を果たしています。受容体がリガンドによって活性化されると、受容体の立体構造が変化し、セル内でGタンパク質の活性化が引き起こされます。活性化されたGタンパク質は、カルシウムを含む様々な細胞内メッセンジャーのカスケードを誘導する可能性があります。FLIPRシステムはハイスループットで機能的な細胞ベースアッセイを行うシステムであり、蛍光カルシウム感受性レポーター色素を用いて検出される細胞内カルシウムの変化を評価する創薬に適したシステムです。ここでは、均一性、迅速性、信頼性の高い蛍光アッセイであるFLIPR®カルシウムアッセイキットを用いて、FLIPRシステムでカルシウム動員アッセイを行うための基本的なプロトコールを提供します。
FLIPRカルシウムアッセイキットによる細胞内カルシウム測定の比較 > -
Gq共役タンパク質レセプター
活性のモニタリング
Gqタンパク質共役型レセプターの活性化は、一般的に、蛍光プレートリーダー上のカルシウム感受性色素を用いて、生きたセルでリアルタイムにモニターされます。プレートリーダー内の自動リキッドハンドリングは一般に、マイクロプレート内のセルにアゴニスト化合物を送達するために必要であり、その間に検出システムは化合物による蛍光強度値の変化をリアルタイムで読み取ります。得られたカイネティック測定の解析から、アゴニストやアンタゴニストのEC50値やIC50値など、化合物の反応プロファイルに関する情報が得られます。
インジェクターモジュール付きSpectraMax i3xリーダーで Gqタンパク質共役型受容体の活性化をモニターする > -
神経細胞アッセイ
FLIPRシステムは、神経細胞の活動に関連するカルシウムフラックスをモニターするための優れたツールです。新たに開発された市販のiPSCニューロンは、ハイスループットニューロナルスクリーニングを現実のものとしました。これらのセルとアッセイは、神経細胞の培養条件、薬物化合物の効果、環境神経毒の影響など、さまざまな因子のモニタリングに不可欠です。神経細胞の活性と神経伝達物質の放出は、蛍光ベースのカルシウムインジケータ色素を用いて評価することができ、高速でシンプルかつ強力なアッセイとスケーラブルなスループットが組み合わされています。
複合事象解析によるヒトiPSC由来神経スフェロイド3次元培養における化合物影響の神経毒性プロファイリング >
3DヒトiPSC由来神経スフェロイドを用いた神経毒性プロファイリング >
神経活性化合物効果の表現型的特徴づけ >
神経3D細胞モデルを用いた神経毒性評価のためのマルチプレックスアッセイ >