Application Note SpectraMax MiniMaxサイトメーターで
FUCCIスフェロイドの画像を取得し、
解析する。

  • 細胞イメージングにより生きた細胞の細胞周期進行をモニター
  • スフェロイドの複数のパラメーターを簡単に解析
  • SoftMax Proソフトウェアでカスタムスフェロイド解析をデザイン
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キャロライン・カルドネル｜アプリケーション・サイエンティスト｜モレキュラー・デバイス

はじめに

スフェロイドは、低接着性マイクロプレートなどの様々な特殊培養法を用いて増殖させた、小さな三次元（3D）細胞微小環境である。この3D細胞培養は、in vitroモデルに高度な臨床的・生物学的関連性を与え、現在では化合物の毒性学や癌などの主要疾患を研究するためのハイスループット・スクリーニング（HTS）や高度細胞培養に広く用いられている。多細胞腫瘍スフェロイド（MCTS）は、腫瘍の組織を模倣したモデルであり、マイクロプレート内の細胞単層などの従来の2D環境と動物モデルとのギャップを埋めるために頻繁に使用されている。3D技術は、in vivoでのがん細胞の生物学をより正確に再現し、新しい抗がん戦略を評価するのに有用であることが広く受け入れられている1。

FUCCI（蛍光ユビキチン化ベースの細胞周期インジケーター）スフェロイドは、細胞周期の様々な段階にある細胞を同定できるため、がん細胞周期の進行を研究するために開発された。FUCCI技術は、それぞれ緑色の蛍光色素（gemininはAmCyan）と赤色の蛍光色素（Cdt1はmCherry）と融合した2つの修飾細胞周期依存性タンパク質、gemininとCdt1の過剰発現に基づいている。Cdt1とジェミニンのレベルは、細胞周期を通して異なって変動する： Cdt1レベルはG1期でピークに達するが、ジェミニンレベルはS期後期、G2期、M期で上昇する。この結果、FUCCI発現細胞の核はG1期で赤く、S期後期、G2期、M期で緑色に見える（図1）2,3,4。

SpectraMax® i3x Multi-Mode Microplate ReaderとSpectraMax® MiniMax™ 300イメージングサイトメーターには、透過光（TL）、緑色（Ex/Em：460/541）、赤色（Ex/Em：625/713）の蛍光チャンネルが装備されています。MiniMax サイトメーターとSoftMax® Pro ソフトウェアは、さまざまな細胞のイメージングと解析に使用できます。ここでは、MiniMaxサイトメータでFUCCIスフェロイドの画像を簡単に取得・解析できることを示す。

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図1. FUCCI細胞周期解析。mCherry-CdtおよびAmCyan-geminin蛍光標識細胞周期タンパク質は、細胞がG1期には赤く、S期、G2期、M期には緑色に見えるように、細胞周期の異なる段階で発現または分解される。細胞イメージングを用いて、様々な実験条件下で細胞周期をモニターすることができる。

材料

  • SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製、型番：i3x）
  • SpectraMax MiniMax 300イメージングサイトメーター（Molecular Devices社、商品番号5024062）
  • コーニング 96 ウェル超低吸着 U 底プレート (Corning cat. #7007)
  • A375S FUCCI細胞（Institute of Cancer Research, Londonより提供）
  • DMEM/F12培地（Invitrogen社のカタログ番号11320-033）
  • EGF（Invitrogen社のカタログ#PHG0311）
  • B27サプリメント（Invitrogen cat #17504001）

方法

スフェロイドの作製と培養

FUCCIレポーターであるmCherry-Cdt1およびAmCyan-gemininを発現する細胞は、Dufauら1によって概説された手順に従って、Institute of Cancer Research（ICR）で作製した。EGF（20ng/mL）とB27（1x）を添加したDMEM/F12中で、1ウェル当たり1000個の細胞をコーニング96ウェル超低付着U底プレートに播種した。プレートを遠心（6分、800g）し、37℃、5％CO2でインキュベートした。最後に、スフェロイドを10％FCSを含む培地で3回洗浄してEGFとB27を除去し、この培地で1～6日間培養した。

データ解析

MiniMaxサイトメーターの透過光チャンネルは、ピンぼけ画像から最良の結果を得た。細胞コンフルエント領域を識別するために、SoftMax Proの "Field Analysis "で新しいカスタムデータ解析を開発した。オブジェクト分類を適用して、スフェロイドと、破片や個々の細胞のような他のオブジェクトを識別し、分析から除外した（図2、AおよびE）。最後に、画像から不要な物体を除外するために関心領域を選択した。緑色または赤色蛍光チャンネルでは、スフェロイドはサイズとバックグラウンドに対する強度を用いて、"Object Count "で簡単に識別できた（図2、B-D、F-G）。次にソフトマックスプロソフトウェアを使用して、画像の"% Area coverage "とスフェロイドの "Object Area"（µm2）を計算した。撮影と解析の設定を表1に示す。

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図2. FUCCIスフェロイドの画像。A: 透過光、B: 緑色蛍光、C: 赤色蛍光、D: 透過光、緑色および赤色画像を重ねた合成画像、E: SoftMax Pro ソフトウェアにより赤色オーバーレイとして識別されたスフェロイドと、ソフトウェアによりグレーで識別され解析から除外された破片や個々の細胞などのその他のオブジェクトを含む透過光画像。F：同定された領域（物体）が紫色のオーバーレイとして示された緑色の蛍光画像。G：対象物をオーバーレイ表示した赤色蛍光画像。ソフトウェアによって特定され、オーバーレイとして表示された領域が画像解析に使用された。

透過光 緑色蛍光 (541 nm) あ赤色蛍光 (647 nm)
フォーカス調整 1000-1200 µm 1000-1200 µm 1000-1200 µm
露光時間 6 ms 8 ms 2000 ms
データ解析設定 フィールド解析：分類と関心領域を選択したカスタム解析 背景上のサイズと強度による物体数 サイズ：380-2000μm 背景：380-2000μm： 380 背景上のサイズと強度による物体数 サイズ：350-1200μm 背景： 380

表1. FUCCIスフェロイドの取得および解析設定。これらの値は、ここで使用したプレートとこれらのスフェロイドについて示したものである。他のプレートやスフェロイドでは異なる調整が必要な場合があります。

結果

SoftMax Pro ソフトウェアの取得および解析設定により、透過光および緑色と赤色の両方の蛍光チャネ ルで、ウェルごとに単一のスフェロイドを迅速かつ容易に同定することができます。SoftMax Proは、すべてのチャンネルで、カバーされた領域のパーセンテージと対象領域の面積（µm2）を計算することができる（図2、表2）。最良の結果が得られたのは、緑色または赤色の蛍光チャンネルであった。

FUCCIスフェロイドの場合、赤色画像では滑らかで丸みを帯びたスフェロイドが表示され、緑色画像では表面に小さな進展が見られたことから、スフェロイド内部の細胞は赤色でG1期にあり、表面の細胞は緑色で細胞周期のM期（図2）に入る準備をしていることが確認された。

このソフトウェアは、スフェロイドのサイズと形状（真円度パラメータ）の小さな変化も大きな変化も識別できるため、様々な治療、例えば抗がん剤の細胞増殖への影響を調べるのに使用できる（図3）。MiniMaxの緑色および赤色蛍光照明の光学的構成により、3D外観の2Dスフェロイド画像が生成される。

対象物の大きさ（µm

2

)		 面積
透過光 242609 5.5
緑色蛍光 329400 7.5
赤色蛍光 329500 7.5

表 2. FUCCI スフェロイドのデータ解析。オブジェクトの面積（µm2）および1画像あたりの面積の割合は、SoftMax Proソフトウェアで算出した。

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図3. 異なるサイズと形状のFUCCIスフェロイドの画像。赤色チャネルの紫色オーバーレイ（下）で同定領域を示した合成画像（上）。レッドチャンネルのデータ解析：左のスフェロイドのサイズは387000µm2、真円度パラメータは0.43、右のスフェロイドのサイズは184500µm2、真円度パラメータは0.64。

結論

ソフトマックスプロソフトウェアが提供する統合データ解析機能を備えたMiniMaxサイトメーターを使用して、FUCCIスフェロイドの透過光および緑色と赤色の両方の蛍光チャンネルでの画像化と解析に成功した。スフェロイドは、画像でカバーされる面積、対象物のサイズ、対象物の形状など、いくつかの方法で評価することができ、研究者にマルチパラメトリックな細胞ベースの分析範囲を提供する。

ミニマックスサイトメーター付きSpectraMax i3xリーダーは、イメージングの利点とマイクロプレートリーダーの使いやすさをシームレスに組み合わせている。データ収集から解析までのシンプルなワークフローにより、SoftMax ProソフトウェアがFUCCIスフェロイド解析のためのトータルソリューションを完成させる。

参考文献

  1. Dufau I, Frongia C, Sicard F, Dedieu L, Cordelier P, Ausseil F, Ducommun B, Valette A： 化学療法薬の時空間動態効果を評価するための多細胞腫瘍スフェロイドモデル。膵癌におけるゲムシタビン／CHK1阻害剤併用療法への応用。BMC Cancer. 2012, 12 (1): 15-10.1186/1471-2407-12-15.
  2. 多細胞腫瘍スフェロイドモデル。BMC Cancer. 2013, 13:73, 10.1186/1471-2407-13-73
  3. https://di.uq.edu.au/dynamic-tumour-heterogeneity-melanoma-therapy-resources
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