Application Note Symphony®とVersaGel®を用いて培養した3Dスフェロイドから
10倍速くデータを取得する

はじめに

ジェイン・ヘスレー｜シニアアプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス社

コリン・C・ヒリバー｜サイプレ社創設者兼CEO

ほとんどのin vitro細胞培養は2次元（2D）で行われ、細胞は平面上で増殖する。しかし、薬剤をスクリーニングするために細胞を2次元で培養することは、細胞外マトリックス（ECM）からのシグナルが、細胞が異なる化合物にどのように反応するかに影響を与えるかを捉えることができないため、生体内で何が起こるかの限られたイメージしか得られない。その代わりに、がんセルやスフェロイドをマイクロプレートで培養し、3Dマトリックスでイメージングすることで、in vivoの腫瘍微小環境をより忠実に模倣したモデルで薬剤をスクリーニングすることができる。

ここでは、新規の光架橋性3D細胞培養プラットフォームであるSymphony® インストゥルメンテーションとVersaGel® ECMハイドロゲルをImageXpress® マイクロコンフォーカルハイコンテントイメージングシステムと組み合わせ、ハイスループットなスクリーニングに適した3Dアッセイを実証する。VersaGelは、in vitroおよびex vivoの3Dアッセイに使用される光架橋性ECMハイドロゲルです。この調整可能なECMハイドロゲルはヒトの生理を再現し、多くの種類のセルをサポートする。がん細胞の懸濁液やスフェロイドをVersaGelに封入することができる。いったんセルが樹立されると、化合物を添加し、次いで細胞染色を行い、その後培養液をイメージングすることができる。

さらにスループットを向上させるため、MetaXpress®ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェアを使用すると、1～4個のスフェロイド/ウェルしか観察できない実験でもQuickIDを使用できます。QuickIDでは、プレート全体を低倍率で高速スキャンし、スフェロイドを含むウェルまたは視野のみを高倍率で複数のZ平面で再イメージングする。ImageXpress®マイクロ共焦点システムでシンフォニーとVersaGelを使用することで、薬剤スクリーニングに強力なソリューションを提供する簡単なワークフローを説明するために、化学療法化合物で処理した3つの異なるVersaGelの硬さにおける異なるがん細胞株の最適化されたスフェロイド増殖の結果を示します（図1）。

材料

• 実証された癌細胞株 - U2OS, MCF-7, HCT-116
• ガラス底96ウェルマイクロプレート（Greiner社製）
• EarlyTox Caspase-3/7-D NucView 488アッセイキット（Molecular Devices、PN R8348）
• EarlyTox Live/Dead Assay（Molecular Devices、PN R8340）
• VersaGel ECMハイドロゲル（Cypre, Inc.）
• Symphonyインストゥルメンテーション（Cypre, Inc.）
• ImageXpress®マイクロコンフォーカルハイコンテントイメージングシステムとMetaXpressハイコンテント画像取得・解析ソフトウェア（Molecular Devices社製）

3Dバーサゲルでのスフェロイド増殖とイメージング方法

シンフォニーとVersaGel 3D培養プラットフォームは、まず液体VersaGelを体積比1：1で培地中のセルまたはスフェロイドと混合するという簡単な技術を用いる。次に、VersaGelとスフェロイドの混合物をシンフォニーで架橋し、プレート全体に低強度の青色光を60秒間照射してウェル内のゲルを重合させる。その後、ImageXpress® Micro Confocalシステムを用いてスフェロイドをイメージングすることができる。VersaGelはマイクロポーラスなので、マトリックスに封入した後、細胞を低分子化合物や抗体で処理し、染色し、ホルムアルデヒド固定することができる。マトリックスはプレートに接着したままであり、固定後の構造を損なうことなく4℃で保存することができる。

QuickIDの特定のオブジェクトを用いたイメージング効率の向上
QuickIDは、96ウェルプレート内でイメージングするスフェロイドを特定のオブジェクトにすることでイメージングを効率化した。まず、2倍の対物レンズを使用して、1視野でウェル全体を撮影した。対象オブジェクトが特定され、そのXおよびY座標が、複数のZ平面にわたる3つのWavelengthで高倍率の画像を自動的に得るために使用された。このプロセスは、手動でスフェロイドを高倍率で撮像するよりも10倍速く、保存が必要な高解像度の画像の生成は20倍少なかった（図2）。

増殖および染色条件の最適化

MCF-7乳がん細胞由来のスフェロイドの培養条件を最適化するために、まず単一スフェロイドを、丸底96ウェルプレートに1,500細胞/ウェルをプレーティングして超低付着マイクロプレートで増殖させ、3～5日間培養した。次に、培地中のスフェロイドを3種類のVersaGel製剤と体積比1：1で組み合わせ、50μL/ウェルをガラス底96ウェルマイクロプレートに移した。Symphonyインストゥルメンテーションを用いてゲルを重合し、カプセル化したスフェロイドをさらに3日間増殖させた後、固定し、HoechstとPhalloidin-AlexaFluor 546で染色した。MCF-7スフェロイドの共焦点画像から、スフェロイドは通常、硬いVersaGel中ではよりコンパクトに保たれ、柔らかい製剤中ではあまり球状に成長しないことが明らかになった（図3）。

EarlyToxアッセイキットを用いたスフェロイドに対する化合物の影響試験

U2OS骨癌スフェロイドの生存率を測定するために、EarlyTox™ Live/Dead Assayを使用した。生きた予備形成スフェロイドをVersaGel中で架橋した後、さらに2日間増殖させ、その後48時間化合物で処理した。スフェロイドは、2次元細胞培養に通常使用される2倍の色素濃度で染色し、2倍の時間インキュベートした。QuickIDを用いてスフェロイドを同定し、死染色（赤）と比較した生染色（緑）の有無を測定した（図4A）。結果（図4B）により、シンフォニーおよびVersaGelプラットフォームと予め形成されたスフェロイドの使用が、EarlyTox Live/Dead Assayに適合することが確認された。

次に、標準的な VersaGel で培養した HCT-116 結腸癌スフェロイドを用い、EarlyTox™ Caspase 3/7 Assay を用いた。スフェロイドを3種類の化合物で48時間処理し、QuickIDを用いてアポトーシス核（緑色）の存在を同定・測定した（図5）。分析の結果、化合物に対する予想通りの反応が示され、EarlyTox Caspase 3/7 NucView 488 AssayとSymphonyおよびVersaGelプラットフォームとの適合性が確認された。

2D投影の解析でも3D解析と同じ結論が得られた

MetaXpress®ソフトウェアを用いて、HCT-116スフェロイドのアポトーシスを2D解析と3D解析で比較した。スフェロイドをVersaGelに浮遊させ、複数のz平面を取得してスフェロイドの深さにわたる画像を収集した。すべての画像は3D対物レンズを構築するために保存され、単一の2Dベストフォーカス投影画像（図6A）を作成するためにも使用された。

アポトーシスをEarlyTox Caspase 3/7 NucView 488 Assayを用いて測定し、2D投影の解析を3D対物レンズの解析と比較した。グラフ解析により、2Dおよび3D解析の両方を用いて、エトポシド処理がHCT-116細胞のアポトーシスを増加させることが示された（図6B）。

結論

シンフォニーと VersaGel は、ImageXpress® Micro Confocal システムと組み合わせることで、3D スフェロイドアッセイに優れたイメージング品質を提供するシンプルな 3D 培養プラットフォームです。このプラットフォームは非常に汎用性が高く、腫瘍腫瘍学研究に理想的である。あらかじめ形成されたスフェロイドをVersaGelに移植することも、マイクロプレート内のVersaGel中で直接細胞を培養することもできます。VersaGelの硬さは、最適なスフェロイド培養のために調整することができます。

QuickIDはプロセスを合理化するため、標準的なイメージングよりもはるかに短時間で画像を取得し、保存の必要性を減らすためにはるかに少ない画像を生成します。さらに、MetaXpress画像解析ソフトウェアは、細胞画像を重ね合わせ、3D対物を構築し、画像を解析用の単一の2Dプロジェクションに折り畳み、陽性細胞をセグメンテーションする機能により、3D細胞解析ワークフローを簡素化する。

この実験により、SymphonyおよびVersagel 3DアッセイとImageXpress® Micro Confocalシステムの組み合わせは、薬剤スクリーニングを次のレベルに引き上げることができる、多用途で強力なソリューションであることが示されました。