Application Note SoftMax Proソフトウェアによる心筋細胞スフェロイド収縮の解析

はじめに

化合物スクリーニングのための細胞ベースのモデルは、生物学的システムの複雑さを表現するために、より複雑になってきています。ライブセルイメージングと三次元モデルは、生きた細胞の構造と細胞プロセスに関する貴重な洞察を提供します。最近、肝臓1、膵臓2、神経細胞3、心臓組織4など、さまざまな種類のヒト組織を表現する複雑なオルガノイド・モデルの開発が大きく進展している。心臓スフェロイドはin vitroで収縮し、様々なモジュレーターの効果に反応する。ここでは、in vitroにおける心筋スフェロイドの拍動パターンのモニタリングと特性評価に使用できる、イメージングと解析プロトコルを含む方法について述べる。

心毒性研究の場合、拍動している心筋細胞の挙動をリアルタイムで見ることができるため、透過光、位相差、蛍光イメージングを用いて、1つのアッセイからマルチパラメーター結果を収集することができる。薬剤開発の初期段階で化合物の心毒性をスクリーニングすることにより、心血管系への悪影響による後期段階の薬剤の失敗に関連するコストを大幅に削減することができる。このため、心筋細胞スフェロイドのような、生物学的に関連性の高い、ハイスループットかつハイコンテントなスクリーニングツールの開発が行われている。

ハイコンテントスクリーニングアッセイでは大量のデータが生成されるため、迅速な自動解析が必要となります。SoftMax® Pro Import機能により、ハイコンテントイメージングシステムを含むあらゆる科学的ソースからの数値データを解析することができます（図1）。画像ベースの蛍光強度データをSoftMax Proソフトウェアにインポートすることで、心毒性化合物パネルで処理した心筋細胞スフェロイドの拍動パターンを図示し、定量化することができました。

材料と方法

スフェロイドラット心筋微小組織（InSphero AG、スイス）を96ウェルGravityTRAP™（InSphero AG）アッセイプレートで培養した。DMSO、0.1 µMイソプロテレノール、0.1 µMプロプラノロール、1 µMベラパミル、1 µMシサプリド、または1 µMリドカインを添加する前に、スフェロイドをカルシウム色素（EarlyTox™心毒性キット、#R8210、Molecular Devices）で2時間処理し、さらに30分間処理した。

処理したスフェロイドは、ImageXpress® Micro XLS System（固定細胞アッセイまたは生細胞アッセイ、組織、小生物の蛍光、透過光、位相コントラストイメージングが可能な広視野自動（1x-100x）顕微鏡）を用いて、タイムラプスモードで毎秒10回、10倍の倍率で合計300時間撮影した。

タイムラプス画像は、蛍光強度（FI）の測定値としてMetaXpress® High-Content Image Acquisition and Analysis Softwareで定量化された。動態FI値はMicrosoft Excelにエクスポートされ、Excelベースのインポートテンプレートにアレンジされ、SoftMax Pro v6.4.2にインポートされた。データは、www.softmaxpro.com からダウンロード可能な、あらかじめ記述された心筋細胞拍動 i3 (Advanced) プロトコルを用いて解析し、ピークカウント、ピーク周波数、ピーク振幅、平均ピーク幅および標準偏差、平均ピーク上昇時間および標準偏差、平均ピーク減衰時間および標準偏差、平均ピーク間隔および標準偏差、平均ピークボトム幅および標準偏差、ピークの規則性の14項目のピーク属性を自動的に算出した。

結果

この研究では、InSpheroの拍動スフェロイドラット心筋微小組織を心毒性化合物パネルで処理し、心筋細胞の収縮に関連する細胞質カルシウム濃度の変化を測定するために最適化されたカルシウム感受性色素を含むEarlyTox心毒性キットを用いてアッセイした。処理した心筋細胞スフェロイドの拍動挙動を観察するために、ImageXpress Micro XLSシステムを用いてタイムラプス画像を撮影した（図2）。得られた蛍光強度の振動を、Excelベースのインポート機能テンプレートを介してSoftMax Pro v6.4.2にインポートし、ピークパラメーターと心拍動に対する化合物の効果を定量化した（図3a）。イソプロテルノルト処理心筋細胞スフェロイドの拍動頻度は増加したが、プロプラノロール、シサプリド、リドカイン処理心筋細胞スフェロイドの拍動頻度はコントロールと比較して減少した。拍動頻度の減少に加えて、シサプリド処理は心筋細胞スフェロイドの拍動パターンを破壊した。カルシウムチャネル遮断薬であるベラパミルで心筋細胞スフェロイドを処理すると、カルシウムシグナルが阻害された（図3bおよび4）。これらの結果は、先行研究5,6と一致している。

結論

生物学的に関連性のある細胞ベースのモデルを用いてハイコンテンツかつハイスループットの心毒性スクリーニングアッセイを実施し、開発の初期段階で心毒性を有する薬剤候補を排除することにより、薬剤開発の時間とコストを大幅に削減できる可能性がある。ハイスループットおよびハイコンテントスクリーニングアッセイの効率を維持するためには、同様に迅速なデータ解析が必要です。SoftMax Pro v6.4.1以降で利用可能なSoftMax Pro Import機能は、イメージングシステム、リアルタイムPCRシステム、Molecular Devices社製以外のプレートリーダー、シンチレーションカウンターなど、さまざまな科学機器から取得したマイクロプレート形式の数値データの解析を可能にします。ExcelベースとXMLベースの2種類のインポートオプションにより、手動インポートから完全自動のデータインポートおよび解析まで、さまざまな自動化機能を提供します。Peak Proソフトウェアのアルゴリズムとプロトコルに加えて、SoftMax Proの数式システムとSyntax Helperは、特に心筋細胞や心筋細胞スフェロイドの拍動などのマルチピーク振動データの定量化に使用され、IC50プロットや条件付き合否結果など、必要な結果を得るのに役立ちます。カスタマイズしたプロトコルは保存して繰り返し使用できるため、データソースに関係なく効率的で一貫性のある解析が可能です。

参考文献

1. Kermanizadeh A, Løhr M, Roursgaard M, et al. 新規の初代ヒト3D肝臓微小組織モデルを利用した、人工ナノ材料の単回および複数回暴露後の肝毒性学。Particle and Fibre Toxicology. 2014; 11:56.
2. Zuellig RA, Cavallari G, Gerber P, Tschopp O, Spinas GA, Moritz W, and Lehmann R. Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2014 doi: 10.1002/term.1891
3. Kraus D, Boyle V, Leibig N, Stark GB, and Penna V. The Neuro-spheroid-A novel 3D in vitro model for peripheral nerve regeneration. Journal of Neuroscience Methods. 2015; 246:97-105.
4. Zuppinger C, Agarkova I, Moritz W, and Kelm J. A human 3D myocardial microtissue model for cardiotoxicity testing. ポスター発表： EUROTOX 2013。第49回欧州毒性学会大会。2013年9月1-4日；スイス、インターラーケン。
5. シレンコ O、クロムウェル EF、クリッテンデン C、ウィグナル JA、ライト FA、ルシン I. ヒト人工多能性幹細胞における拍動パラメータの評価により、心毒性の定量的試験管内スクリーニングが可能になった。Toxicology and Applied Pharmacology. 2013; 273(3):500-507.
6. Sirenko O, Crittenden C, Callamaras N, Hesley J, Chen YW, Funes C, Rusyn I, Anson B, and Cromwell EF. iPSC 細胞を用いた心筋細胞生理に対する化合物効果の多項目体外評価。Journal of Biomolecular Screening. 2013; 18:39-53.

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