Application Note ImageXpress Microシステムで
EarlyTox Caspase-3/7-D NucView 488アッセイキットを用いたアポトーシス検出

はじめに

アポトーシスは、胚発生などの正常過程や、癌や神経変性疾患などの疾患において、細胞のプログラム死をシグナル伝達する重要な機構である。

EarlyTox™ Caspase-3/7 NucView 488アッセイキットは、NucView 488 Caspase-3基材を使用することにより、インタクトな細胞集団内のアポトーシスを検出することができます。この基質は、カスパーゼ-3/7 DEVD認識配列に結合した蛍光性DNA色素から構成されている。最初は無蛍光で、細胞膜を透過する。細胞がアポトーシスしている場合、細胞基材はカスパーゼ-3/7によって切断され、核に入りDNAに結合する色素を放出し、明るい緑色の蛍光を発する。死細胞やアポトーシス細胞を除去する可能性のある洗浄ステップなしで、細胞を生きたままイメージングすることができるが、色素は固定後も保持される。

このフレキシブルなアッセイは、ImageXpress® MicroハイコンテントイメージングシステムとMetaXpress®解析ソフトウェアを用いてウェル中のアポトーシス細胞の発生率を計算することができます。

材料

• EarlyTox Caspase-3/7-D NucView 488 Assay Kit (Explorer Kit Cat. No. R8350またはBulk Kit Cat. No. R8351、DMSO製剤)
• CHO M1WT3細胞
• カンプトテシン
• 384ウェル黒色透明底マイクロプレート（Corning Falcon）
• DRAQ5核染色
• ImageXpress Micro ハイコンテントイメージャーシステム

アッセイ方法

CHO細胞を384ウェル組織培養処理マイクロプレートに1ウェルあたり50μLで3,500個プレーティングした。37℃、5% CO2のインキュベーター内で一晩接着させ、増殖させた。その後、アポトーシスを誘導するために、100 µMから0.1 µMまでのカンプトテシン（抗がん剤）の1:2希釈系列でウェルを24時間処理した。

NucView 488基質の10 µM 2Xワーキング溶液を温めた培地で調製した。各ウェルから25µLを注意深く吸引し、25µLの2X基質溶液と交換して最終濃度を5µMにした。細胞を37℃で1時間インキュベートした後、DRAQ5核染色液の6倍液を各ウェルに10µLずつ加え、最終濃度を2µMとした。30分間のインキュベーション後、FITCおよびCy5フィルターセットと10X Plan Apo対物レンズを用い、ImageXpress Microシステムでプレートを読み取った（図1）。この倍率では、1視野で通常1,100～1,400個の核をとらえるので、1枚の画像で統計学的に適切な結果が得られる。

データ解析

ImageXpress®マイクロイメージングシステムで撮像されたセルは、Cell Scoringモジュールを用いてMetaXpress®ソフトウェアで解析された。直感的なユーザー入力により、このモジュールはDRAQ5で染色された核を総セル数として同定し、Caspase 3/7陽性の核をアポトーシスとして分類する。核のサイズ、強度、アポトーシスの割合など複数のパラメータを評価することができる。化合物曝露に反応する肉眼的毒性がアポトーシスの評価を妨げる場合、細胞数が特異性を下回るウェルは解析から除外することができる。

結果

アポトーシス細胞のパーセント対カンプトテシン濃度をグラフ化し、4パラメータカーブフィットを適用した結果、EC50値が5.7 µMの濃度応答曲線が得られた（図2）。ImageXpress MicroシステムおよびMetaXpress®ソフトウェアとともに使用されるEarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 Assay Kitは、科学者にアポトーシスの迅速かつロバストな画像ベース定量を提供する。

このMolecular Devicesシステムとの互換性

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