Application Note ImageXpressハイコンテントスクリーニングシステムによる
心毒性アッセイ
- 人工多能性幹細胞由来の化合物の細胞毒性効果を評価
- 臨床試験の後半で予期せぬ心臓の副作用を減らすことにより、創薬プロセスを迅速化する
- マルチプレックスセルベースアッセイによるハイスループットスクリーニングの実施
PDF版（英語）
はじめに
新規薬剤の発見と開発は、ヒトの生理学的反応を実験室内で正確に再現するツールや技術がないため、困難でコストのかかるプロセスである。ImageXpress®マイクロシステムのようなハイコンテントイメージングシステムを用いることで、人工多能性幹細胞由来の適切なヒト心臓細胞に対する化合物の細胞毒性効果を評価することができる。
ライブ/デッドアッセイによる細胞毒性解析
膜透過性カルセインAMは、生細胞ではエステラーゼによって切断され、細胞質で緑色の蛍光を発する。死細胞では細胞膜が破壊され、色素であるエチジウムホモダイマーが侵入し、核を染色する（図1）。
***図1. 細胞毒性アッセイ。*
毒性化合物の濃度を増加させながら曝露した心筋細胞（左から右へ）。生細胞は緑色の蛍光を示し、高用量になるほど赤色に染色された死細胞の発生率が増加する。
ヒト人工多能性幹細胞（iPsc、Cellular Dynamics Intl.社製iCell Cardiomyocytes）由来の心筋細胞を、様々な濃度の薬剤とともにインキュベートし、ハイコンテントイメージングを用いてカディオ毒性を解析した（図2）。バリノマイシン（カラム9と10）は、試験した最低濃度でも高い心毒性を示した。
図2. 毒性アッセイのホールウェル画像。心筋細胞を5種類の化合物の8点用量反応に対してスクリーニングし、二重に試験した。9列目と10列目の化合物Valinomycinは、試験した最低用量でも毒性を示した（H行目）。
図3. 毒性用量反応曲線。. 48時間の薬物処理後、6種類の化合物について実行した生死アッセイの正規化結果。
JC-10によるミトコンドリア膜偏光解消のモニター
JC-10は健康な細胞のミトコンドリア内で凝集し、570 nmでオレンジ/赤色のエミッションを発する。化合物の中には、ミトコンドリアの膜電位を破壊することにより、直ちに毒性作用を引き起こすものがある。ミトコンドリア膜が障害されると、JC-10単量体は細胞質内に拡散し、530 nmで発光する。ミトコンドリア膜の変化を定量的に検出するには、570 nm/530 nmの蛍光強度比をモニターするか、単純にセルあたり検出されたオレンジ色のミトコンドリアの量を定量します。
ImageXpressマイクロシステムは、ハイスループットな細胞毒性試験のための画像取得と解析を自動化するための完全統合型ハードウェアおよびソフトウェアシステムです。オプションで環境制御を設定すれば、生きた細胞の反応やカイネティック反応を数日間リアルタイムでモニターすることができる。この研究では、心筋細胞をインキュベートし、アンチマイシンAの濃度を増加させた。保存した画像はいつでも確認でき、MetaXpress®ソフトウェア・アプリケーション・モジュールの一つを用いてさらに解析することができた。
図4. JC-10ミトコンドリア膜電位アッセイ。アンチマイシンAの濃度を上げると、ミトコンドリア膜の偏光解消が進み、緑色蛍光細胞質に対する赤色染色ミトコンドリアの比率が低下する。生細胞イメージング画像は、環境制御付きImageXpressマイクロシステムを用いて20倍で取得した。I
概要
ImageXpress Microシステムは、全細胞細胞毒性アッセイとミトコンドリア膜偏光解消アッセイの両方において、ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞を用いたin vivo薬剤心毒性解析のための強力なシステムである。このシステムは、創薬プロセスの早い段階で化合物の細胞毒性に関する重要な情報を製薬科学者に提供し、臨床試験の後半で予期せぬ心臓の副作用を減らすのに役立ちます。
ImageXpress Micro XLSの詳細はこちら >>
PDF版（英語）