Application Note ヒトiPSC由来心筋スフェロイドを用いた
心筋細胞生理に対する薬物効果の評価

はじめに

生体内の微小環境をよりよく模倣し、化合物の有効性と毒性をより正確に予測するために、セルモデルはより複雑になってきている。組織バイオロジーや毒性評価のモデリングに3Dスフェロイドを用いることへの関心が高まっている。三次元培養を用いてハイスループットで定量的なアッセイを開発することは、活発な研究分野である。本研究では、ヒト人工多能性幹細胞（iPSC）由来の3Dスフェロイドの形成法を開発した。ハイコンテントイメージャー（HCI）と高速カイネティックイメージャー（FLIPR）の両方を用いて、カルシウム感受性色素による細胞内カルシウムレベルの変化をモニターしながら、様々な化合物が心筋スフェロイドの拍動速度とパターンに与える影響を測定した。

心臓スフェロイドの形成

本試験では、Cellular Dynamics International（CDI）社製の凍結保存iCell心筋細胞2を用いた。細胞を解凍し、超低密着（ULA）U底96ウェルプレートに20,000細胞/ウェル、または384ウェルプレート（コーニング）に10,000細胞/ウェルでプレーティングし、維持培地で4日間培養してスフェロイド培養を行った。心臓スフェロイドは、48時間以内にiPSC由来の心筋細胞から効率よく形成され、培養3～4日後には自発的に収縮を始めた。これらの3D細胞モデルは、Ca2+感受性色素で染色することにより、心毒性評価に用いることができた。細胞内Ca2+フラックスに対する蛍光強度の変化を、スフェロイド収縮の代用マーカーとして用いた。心活性化合物および心毒性化合物に反応して、ベースラインの拍動パターンに有意な変化が観察された。

iPSC 由来の心筋スフェロイドの拍動パターンを記録、定量、特徴付けるための 2 つの方法について説明する。ハイコンテントイメージャー（ImageXpress® Micro ハイコンテントイメージングシステム） と高速カイネティックイメージング（FLIPR Tetra® ハイスループット細胞スクリーニングシステム）を使用する。

ハイコンテントイメージャーによる心臓スフェロイドの経時的画像取得と解析

イメージング法は、心臓スフェロイドの正確な検出と可視化を可能にし、所望の期間と頻度にわたる画像のタイムラプススタックの取得を含む。本研究で用いたアッセイワークフローを図1に示す。ImageXpress® Micro Confocalシステムは、自動タイムラプス取得を用いてスフェロイド画像を取得した。スフェロイド全体のカルシウムフラックスパターンが記録され、収縮と同期していることがわかった（図2）。記録周波数は10-20回/秒に設定され、FITC励起およびEmissionフィルターを用いて、20倍または10倍の倍率で、1ウェルあたり5-10秒（またはそれ以上）の読み取りを行った。セルは、環境制御下（37℃、5% CO2）または密閉下に保った。読み取り頻度を上げるため、励起時間は10ms以下とした。このイメージング法は、どのようなスフェロイドサイズでも効率的に機能する。ウェルあたり3,000～20,000個のプレーティング細胞から調製したスフェロイドをテストした。その結果、拍動頻度はスフェロイドのサイズに依存しないことが示された（データは示さず）。細胞は、Hoechst核染色とFLIPR® Calcium 6 Dye（Molecular Devices社、LLC）を用いて、標準的な推奨プロトコールに従って染色した。

画像の解析にはMetaXpress Journal（リクエストにより入手可能）を使用した。ジャーナルは自動的にスフェロイドを見つけ、各時点での平均蛍光強度を決定し、各時点の強度データをプレート形式で保存する。スフェロイド画像のタイムラプススタックを保存することで、イメージングソフトウェア内にビデオクリップを保存することができる。表示モードで強度対時間を視覚化することにより、拍動パターンをレビューすることができます。各タイムラプスの強度データは、エクセル形式でエクスポートすることもできます。強度データをインポートし、拍動パターンを解析し、フラックス数、拍動周波数、振幅、ピーク幅、ピーク間距離、ピーク上昇時間、減衰時間などの主要パラメーターを定義します。これらのパラメータは、観察された化合物効果（拍動頻度の増減、振幅、ピーク幅、減衰時間の変化など）の用量依存性を決定するために用いることができる1,2。いくつかの試験化合物で観察されたカルシウムフラックス頻度の濃度依存曲線を図4に示す。表1には、カルシウムフラックス頻度を読み取り値として用いて算出された化合物のIC50値が示されている。

ハイコンテントイメージャーを用いたスフェロイド生存率の評価

このハイコンテントイメージャーアプローチは、細胞生存能に対する様々な化合物の影響を明らかにするためにも使用できる。例えば、我々は、化合物処理後の心臓スフェロイドの細胞生存能を、生存率色素の組み合わせで染色することにより評価できることを示した： カルセインAM（エステラーゼ活性に依存する生細胞染色）、エチジウムホモ二量体（細胞不透過性の死細胞インジケーター）、ヘキスト（細胞透過性の核染色で、生細胞集団と死細胞集団の両方を含む全細胞をマークする）。染料で2時間インキュベートした後、染色したスフェロイドをImageXpress® Micro Confocalシステムを用いてイメージングした。画像のZ-スタックを10倍または20倍の倍率で、10μm間隔で、◎～◎150μmの範囲で取得した。画像はMetaXpress®ソフトウェアで2Dおよび3D解析モジュールを用いてスフェロイド内の生細胞と死細胞の合計について解析した。生存率マーカーについてスフェロイドを解析する方法は前述した3。図5は、コントロールとジゴキシン処理スフェロイドの解析例を示す。細胞数、スフェロイドサイズ、細胞生存能の測定値を用いて、化合物効果のマルチパラメトリック評価を行うことができる。

FLIPR Tetraシステムを用いて拍動心筋細胞スフェロイドのCa2+ Fluxをモニタリングし、ハイスループットスクリーニングを最適化する。

ハイコンテントイメージャーシステムでは、一度に1つのウェルのみをタイムラプスイメージングしますが、FLIPR Tetraシステムでは、プレート全体の蛍光強度を同時に読み取るため、すべてのウェルのカルシウムフラックスを同時にカイネティック測定することができます。また、自動リキッドハンドリングやプレートハンドリングにも対応しています。ScreenWorks Peak Pro ソフトウェアモジュールは、拍動プロファイルの解析および特性評価に使用でき、拍動速度、ピーク周波数および幅、または波形の不規則性などのマルチパラメトリック出力が得られます。

iPSC 由来の心臓スフェロイドを用いたカルシウム流動アッセイは、FLIPR Tetra® システムを用い、96 ウェルまたは 384 ウェルプレートでのハイスループット・スクリーニング（HTS）用に最適化された。心筋スフェロイドは、既述のように低付着性Uボトムプレートで形成した。スフェロイドのサイズが比較的大きい場合（300-500 μm、10,000-20,000個のプレーティング細胞で形成）、FLIPR Tetraシステムはスフェロイドをより効率的に検出することが確認された。細胞拍動に同期したCa2+フラックスの変化をモニターするために、FLIPRカルシウム6色素を使用した。試薬（2倍濃度）をプレートに加え、37℃、5% CO2で2時間インキュベートした。スフェロイドは2時間または24時間化合物に暴露された。FLIPR Tetraシステムを用い、励起波長485 nm、 Emission波長530 nmの設定で、薬剤投与前のリードを毎秒8フレームで取得した。化合物の露光時間を変化させたときの時間的関係を理解するため、化合物のインキュベーション時間を変化させた後に、追加のリードを取得した。カルシウムフラックスの記録は、ロバスト性のデータセットを得るため、通常2分間行った。

FLIPR Tetra高速カイネティック蛍光イメージングアプローチの高度な3D細胞モデルアッセイへの適用性を説明するために、α-およびβ-遮断薬（イソプロテレノール、プロプラノロール、ベラパミル）、hERGチャンネルに影響を与える既知の化合物（ハロペリドール）、イオンチャンネル遮断薬（リドカイン）など、いくつかの既知の心臓活性化合物および心臓毒性化合物に心臓スフェロイドを曝露した。さらに、農薬（ロテノン）、難燃剤（リン酸トリフェニル）、その他の有害化学物質など、いくつかの環境毒素も試験した。図6Aは、対照および試験化合物処理した心臓スフェロイドのカルシウムフラックス（拍動）パターンを示している。驚くべきことではないが、化合物処理は用量依存的に拍動パターンを劇的に変化させた（図6B）。しかし、3Dスフェロイド培養で得られたIC50値と、従来の2Dフォーマットでプレーティングした細胞で得られたIC50値とをさらに比較すると、アッセイ感度に有意な差が認められ、3D培養では全般的に反応が右シフトする（すなわち、IC50値が高くなる）傾向が見られた（表2）。これらの試験化合物に対する心臓スフェロイド感受性の低下が、従来の2D培養フォーマットよりも実際に予測性が高いかどうかは、さらなる追跡調査が必要である。とはいえ、これらの結果は、小型化したiPSC由来の心臓3D細胞モデルと高速カイネティクスイメージングを組み合わせることで、ハイスループット心臓毒性スクリーニングをサポートできる可能性を示している。

概要

スフェロイド生存率アッセイに加えて、FLIPR Tetraシステムを用いた心筋拍動スフェロイドのカルシウム流動アッセイとタイムラプスハイコンテントイメージングアッセイがHTSに適していることを示した。両システムは、ヒトiPSC由来心筋細胞から誘導したin vitro 3D細胞モデルを用いた潜在的な心毒性の評価に有用である。

参考文献

1. Sirenko, O., C. Crittenden, N. Callamaras, J. Hesley, Y.-W. Chen, C. Funes, I. Rusyn, B. Anson, and E. F. Cromwell. Chen, C. Funes, I. Rusyn, B. Anson, and E. F. Cromwell. "Multiparameter In Vitro Assessment of Compound Effects on Cardiomyocyte Physiology Using IPSC Cells". Journal of Biomolecular Screening 18.1 (2012)： 39-53. Web.
2. Sirenko, Oksana, Evan F. Cromwell, Carole Crittenden, Jessica A. Wignall, Fred A. Wright, and Ivan Rusyn. 「Toxicology and Applied Pharmacology 273.3 (2013)： 500-07. Web.
3. Sirenko, Oksana, Michael K. Hancock, Jayne Hesley, Dihui Hong, Avrum Cohen, Jason Gentry, Coby B. Carlson, and David A. Mann. "Phenotypic Characterization of Toxic Compound Effects on Liver Spheroids Derived from IPSC Using Confocal Imaging and Three-Dimensional Image Analysis". ASSAY and Drug Development Technologies 14.7 (2016)： 381-94. Web.

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