Application Note 比色分析の自動コロニーセレクション：
QPix 400シリーズによる青白色コロニースクリーニング
- 白色光を用いた形質転換効率の効率的なモニタリング
- 白色、青色、パウダーブルーのコロニーを正確かつロバスト性に色識別
- 自動またはユーザー定義の機能を備えたインテリジェントなコロニーセレクションソフトウェアモジュール
PDF版（英語）
はじめに
クローン化された遺伝子を挿入した組換えプラスミドを封じ込めた細菌形質転換体のスクリーニングは、分子クローニングにおいて不可欠なステップである。blue-whiteスクリーニング "と呼ばれる比色分析法は、色に基づく組換えコロニーと非組換えコロニーの簡便な同定を可能にする。blue-whiteスクリーニングは組換え形質転換コロニーの視覚的同定を提供するが、コロニーピッキングプロセスにおける多くの手作業ステップは主観的で時間がかかり、エラーが起こりやすい。
Molecular Devicesの微生物コロニーピッカーQPix™ 400シリーズは、白色光イメージングを用いた正確な青白色比色スクリーニングと形質転換効率の効率的なモニタリングのために特別に設計された自動化ソリューションを提供します。このソリューションには、QPix™ ソフトウェア 2.0 Blue-White ピッキング・モジュール、光学QPix™ Chromaフィルター、および調整可能なQPix™ Chromaフィルターが組み込まれています。
クロマフィルター、および調整可能なソースプレートホルダーが組み込まれています。このアプリケーションハイライトでは、QPix™ 420システムを用いた比色分析コロニースクリーニング実験の結果について説明します。ピッキングされたコロニーの正確性は、DNAシーケンスによってさらに検証されました。
ブルーホワイトスクリーニングの原理
青白コロニースクリーニングの分子メカニズムは、LacZレポーター遺伝子に依存している。この手法では、ß-ガラクトシダーゼをコードするLacZ遺伝子が機能している非組換えコロニーは、X-galを含む培地の存在下で青色に変色する。 これは、遺伝子挿入に成功したためにLacZ遺伝子が破壊された組換えコロニーが白色に変色するのとは対照的である（図1）。
図1. 分子クローニング。典型的なブルーホワイトスクリーニング手順の模式図。細菌コロニーのブルーホワイトスクリーニングには、抗生物質耐性とLacZレポーター遺伝子を持つプラスミドベクターに挿入された遺伝子のクローニングが含まれる。ベクターのマルチプルクローニングサイトにインサートをライゲーションすると、LacZ遺伝子が不活性化される。ライゲーションした混合物でコンピテント大腸菌を培地中X-gal存在下で形質転換すると、青と白のコロニーが形成される。
分子クローニングを用いてコロニーに目的の遺伝子をトランスフェクトする。
モデル構築物を作製するために、ヒトインスリン様成長因子（IGF）遺伝子を、カナマイシ ン耐性およびLacZ遺伝子を含むpUC57-Kanクローニングプラスミドベクターのマルチプルクロー ニングサイト（MCS）にクローニングした（図2A）。化学的にコンピテントな大腸菌（One Shot® TOP10, Life Technologies）を、ライゲーションしたベクターと遺伝子（ヒトIGF）の混合物で形質転換した。形質転換した細菌を、カナマイシ ン、IPTGおよびX-galを封じ込めたLB培地上にプレーテ ィングし、37℃で一晩培養した。挿入された遺伝子を持つベクターと持たないベクターを含むコロニーは、QPix 420システムを用いて、それぞれ白色または青色で同定した（図2B）。
図2. ヒトIGFのpUC57-Kanクローニングプラスミドベクターへのクローニングと青白コロニースクリーニング。(A）遺伝子インサートであるヒトIGFをpUC57-KanプラスミドクローニングベクターのMCSにライゲーションした。(B）青白コロニースクリーニングで用いたLacZレポーターベースの遺伝子発現の結果、X-galを封じ込めたLB培地プレート上に青白コロニーが出現した。
細菌コロニーを封じ込めたペトリプレートを保持する調節可能なソースプレートホルダーを、QPixクロマフィルターを備えたイメージングベッド上に配置した（図3A）。シャーレはプレートホルダーの調節可能なラッチでしっかりと固定し（図3B）、白色光イメージングを行った（図3C）。
図3. QPixシステムを利用した青白色コロニースクリーニングでは、（A）色の識別を強化するための光学QPixクロマフィルター、（B）プラスチック器具の柔軟性を向上させるための調節可能なソースプレートホルダーを使用。白色光下でイメージングされたコロニー（C）は、ソフトウェアでさらに分析される。
青白コロニーを自動選択
QPix 420システムで撮影した白色光イメージングを、使いやすいQPixソフトウェア2.0を用いて解析した。青色（図4A）または白色（図4B）のコロニーは、内蔵の自動選択機能（図4C）を使用して自動的に識別され、個別に選択された。ユーザーはヒストグラムの閾値を調整し、コンパクトさ、軸比、直径、近接性などのコロニーセレクション基準を手動で定義して、選択を最適化することができる。選択された青白いコロニーは、QPix 420システムの完全空気圧式96ピンピッキングヘッドを使用してロボットでピッキングされた。
図4 （A）Auto Select Blueで選択された青いコロニーの例を青い矢印で示す。(B) Auto Select Whiteで選択した白コロニーの例を白矢印で示す。(C) ソフトウエアの柔軟性により、強度のしきい値を手動で調節して、より強力な青色コロニーを選択するなど、結果を最適化できる。
ピッキングしたコロニーのDNA配列の確認
比色分析と青白コロニーピッキングの精度は、挿入遺伝子の存在を確認するためのDNA配列決定によって確認された。ローリングサークル増幅により、ピッキングされた白色コロニーの98％がpUC57-Kanクローニングプラスミドベクターにクローニングされた遺伝子であるヒトIGFを封入していることが確認された。さらに、ピッキングした青いコロニーの100％が、挿入遺伝子を含まない空のpUC57-Kanクローニングベクターを含んでいた。この実験の結果は、微生物コロニーピッカーのQPix 400シリーズを使用した白コロニーと青コロニーの選択における色の識別を確認する上で、説得力のある確信を与えるものである。
概要
青白コロニースクリーニングは、分子クローニングの結果、遺伝子インサートを保有する形質転換コロニーを簡便に区別できる比色分析法です。Molecular Devicesは、QPix 400シリーズの微生物コロニーピッカーでブルーホワイトスクリーニング用に調整された自動化ソリューションを提供しています。QPixソフトウェア2.0のユーザーフレンドリーなソフトウェアインターフェースと光学フィルターにより、白色光下での正確でロバスト性の高い色識別が可能になります。調整可能なラッチ付きプレートホルダーなどのアクセサリーは、プラスチック器具との互換性をさらに向上させます。このように、QPix 400シリーズは、従来の手作業によるコロニースクリーニングに代わる、非常に効率的で信頼性の高いアプローチを提供します。
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