Application Note FlexStation 3リーダーを用いたFLIPR Calcium 6
および6-QFアッセイキットによるカルシウムシグナル伝達

はじめに

Molecular Devices社のFLIPR®カルシウムアッセイキットは、高感度カルシウムインジケータと特許取得済みマスキング色素を使用しており、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）、イオンチャネル、およびその他のカルシウム感受性の高いターゲットの高感度蛍光スクリーニングを行うことができます。カルシウム流動アッセイウィンドウのシグナルをさらに増強する新規色素製剤を使用することで、アッセイのロバスト性を高めるとともに、アッセイプロトコルの柔軟性を高めている。その結果、FLIPR Calcium6 および Calcium 6-QF Calcium Kit 染料は、16 チャンネルピペッターを用いた FlexStation® 3 マルチモードマイクロプレートリーダーのミディアムスループットでの 384 ウェルプレートでのカルシウムフラックス測定に適しています。結果は、ハイスループット・モードの FLIPR®Tetra システムで得られた結果と同様です。

測定原理

図1に示すように、FLIPRカルシウム6測定用色素は細胞の細胞質に入る。マスキングテクノロジーは細胞内には入りませんが、細胞外に残存するカルシウム指示薬、培地、その他の成分に由来するバックグラウンド蛍光を大幅に減少させます。FLIPR Calcium 6-QFアッセイキットはマスキング技術を封じ込めず、クエンチ感受性の高いターゲットやマルチプレックスアプリケーションにフレキシブルなオプションを提供します。アッセイにプロベネシドを使用する必要がほとんどないため、アッセイの柔軟性がさらに高まります。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株のような特定のセルには陰イオン交換タンパク質があり、一般的に使用されるカルシウムインジケータを細胞質内に保持するためには、プロベネシドのような陰イオン再取り込み阻害剤を使用する必要があります。FLIPRカルシウム6アッセイキット独自の色素製剤は、このような有機アニオントランスポーターに対してより耐性があるため、プロベネシドの使用量が少なくて済むか、あるいは不要となる可能性があります。

材料と方法

HeLa細胞に発現する内因性ヒスタミン受容体を調べるアッセイ法を、新しいFLIPRカルシウム6およびカルシウム6-QFアッセイキットを用いて開発し、他の市販キットと比較した。カルシウムフラックスはFLEXstation 3readerの'Flex'Read modeを用いて測定した。継続的に培養したHeLa細胞を、ブラックウォールクリアボトム384ウェルマイクロプレートに、50μLの増殖培地中に5,000細胞／ウェルでプレーティングし、37℃、湿度95％、CO2 5％で一晩維持した。翌日、セルプレートにメーカー推奨の適切なカルシウムキット試薬（水溶性プロベネシドを含む）をプレーティングし、メーカーのプロトコールに従って60分または120分間インキュベートした。

FlexStation 3リーダーの統合型16チャンネルピペッターを用い て、細胞に様々な濃度のヒスタミン（3倍希釈で100 μMから開始）を作用させた。蛍光測定は、最適化されたパラメーターを用いて、化合物添加前、添加中、添加後60秒間行った（Table 1）。アンタゴニスト研究では、FLEXstation 3リーダーのオンボード流体システムを用いてピリラミンとリスペリドン（3倍希釈で30μMから開始）を添加し、30分間平衡化させた。その後、細胞を15 µL/ウェルのヒスタミン（EC80濃度）で刺激し、蛍光強度の変化をリアルタイムでモニターした。

比較に用いたカルシウム指示薬は以下の通りである：

• FLIPRカルシウム6アッセイキット（モレキュラーデバイス社製）
• FLIPRカルシウム6-QFアッセイキット（Molecular Devices社製）
• Fluo-4 ダイレクトカルシウムアッセイキット（ライフテクノロジーズ社製）
• Fluo-4 ダイレクトカルシウムアッセイキット（Life Technologies社製）

表1. FLEXstationリーダーの設定。説明したカルシウムアッセイに最適なインストゥルメンテーション設定を示す。

FlexStation 3リーダーの設定

セルプレートはFlexStation 3リーダー内を37℃に保った。化合物はGreiner 384-well polystyrene deep-well プレートに調製し、化合物の移動にはFLEXstation 3 Tips（黒）を使用した。特異性パラメータを表1に示す。

結果と分析

反応は蛍光強度のピークとして測定された。比較を可能にするため、データはベースラインに対する％反応として正規化し、n=4で平均±標準偏差として表した。濃度反応データの個々のセットを、SoftMax® Proソフトウェアを用いて4パラメータカーブにフィット処理した（図2～5）。

図 2. FLIPRカルシウム6および6-QFアッセイキットは最大のシグナルウィンドウを提供します。ヒスタミンH1はHeLa細胞の内因性受容体である。FLIPR Calcium 6と6-QFを他の色素と比較すると、どちらもシグナルウィンドウが最大であることがわかる。EC80値はHalf-log以内であり、EC80におけるZファクターは同等であった。

図3. HeLa細胞におけるヒスタミン負荷に対するリスペリドン拮抗薬の反応。リスペリドンは統合失調症の治療に用いられる抗精神病薬である。ドパミン拮抗薬であり、抗ヒスタミン作用もある。カルシウム6色素と6-QF色素のシグナルは、アンタゴニストアッセイにおいて最大のウインドウを提供する。IC50値は互いにHalf-log以内であり、カルシウム6-QFはIC50濃度で最も高いZファクターを有する。

図4. HeLa細胞におけるヒスタミン負荷に対するピリラミン拮抗薬の反応。ピリラミンは第一世代のヒスタミンH1拮抗薬である。FLIPRカルシウム6アッセイキットはシグナルウィンドウが大きいため、IC50におけるZファクターは最大である。さらに、Calcium 6-QFキットは、クエンチ感受性の高いターゲットを研究する場合に洗浄を必要としないロバスト性のアッセイも提供します。

図5. FLIPRカルシウム6アッセイ色素は陰イオン再取り込み阻害剤の使用を必要としない。CHO-M1細胞とCalcium 6色素を用いたアッセイでは、プロベネシドとのインキュベーションを必要とせず、カルバコールに対する反応を示す。Fluo-4 Directを用いた対応するアッセイでは、シグナルはほとんど見られなかった。カルシウム6色素は、陰イオン再取り込み阻害剤に感受性のある標的を理解するための重要な新開発である。

結論

FLIPR Calcium6およびCalcium6-QFアッセイキットは、 FlexStation 3リーダーのようなミディアムスループットオプショ ンを含むフレキシブルなカルシウム流動アッセイを提供すると 同時に、信頼性の高い薬理学、優れたシグナルウィンドウ、 高品質なアッセイ性能を提供します。今日の多くのアッセイでは、過剰発現レセプターを 用いた標準的なアゴニストやアンタゴニストアッセイでは見 られない課題があるため、シグナルウィンドウを大きくする ことは重要です。内因性レセプターを持つ細胞株、レセプターの低発現、凍結細胞、初代細胞、幹細胞などを用いると、シグナルウインドウが小さくなる可能性があります。さらに、シグナルウィンドウが大きいと、アロステリックモジュレーターを同定するアッセイを行う際に有利です。

クエンチなしのFLIPRカルシウム6-QFアッセイキットオプションは、クエンチ感受性のターゲットを研究するためのアッセイを可能にする新しいアッセイのフレキシブルなオプションを提供します。最後に、アニオン再取り込み阻害剤非存在下でCHO細胞のような細胞株でターゲットの挙動を研究できることは、一部の受容体やイオンチャネルがプロベネシド感受性である可能性があり、その使用が天然の生物学的メカニズムを変化させる可能性があるため、有益である。FLIPRカルシウム6キットはシグナルウインドウが広いため、化合物のスクリーニングや最適化のためのロバスト性アッセイに適しています。

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