Application Note SpectraMaxマイクロプレートリーダーを使用したレポーターバイオアッセイにより、
免疫チェックポイント阻害の生物製剤を特性評価する

はじめに

Cathy Olsen博士｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜Molecular Devices社
Zhijie Jey Cheng, PhD｜研究開発マネージャー兼シニアリサーチサイエンティストIII｜プロメガ・コーポレーション

免疫チェックポイント受容体は、癌や自己免疫疾患を含む様々な疾患の治療のための有望な免疫療法の標的である。プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）、細胞毒性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）、免疫グロブリンと免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフを持つT細胞免疫受容体（TIGIT）のようないくつかの共阻害受容体、 T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3 (TIM-3)、lymphocyte activation gene-3 (LAG-3)は、がんに対する積極的な免疫療法を開始するための共抑制シグナルを遮断するモノクローナル抗体の標的として同定されている。

さらに、免疫療法の標的を組み合わせた前臨床研究では、これらがT細胞の活性化、抗腫瘍反応、患者の生存に相乗効果をもたらすことが示唆されている。つまたは2つの免疫チェックポイント・レセプターを同時に阻害する治療薬の開発は、in vitro試験において課題を提起している。免疫チェックポイントを標的とする薬剤の活性を測定するために用いられている現在の方法は、初代ヒトT細胞を用い、細胞増殖、細胞表面マーカー発現、インターフェロンガンマやインターロイキン2産生などの機能的エンドポイントを測定するものである。これらのアッセイは、ドナーの初代細胞、複雑なアッセイプロトコール、不適格なアッセイ試薬に依存しているため、手間がかかり、非常にばらつきが大きい。

プロメガ社は、このアプリケーションノートで取り上げた2つの免疫チェックポイント標的、TIGITとCTLA-4を含む、様々な免疫チェックポイント標的の研究と医薬品開発を可能にする一連の機能レポーター・バイオアッセイを開発しました。各キットは、プライマリー細胞培養の必要性をなくし、結果までの時間を短縮するThaw-and-Useセルを提供しています。

TIGIT/CD155 Blockade Bioassayは、2つの遺伝子エンジニアリング細胞株から構成されています： TIGITエフェクター細胞は、TCR活性化とCD226共刺激の両方に反応できるネイティブプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを持つヒトTIGITを発現するJurkat T細胞であり、CD155 aAPC/CHO-K1細胞は、抗原非依存的にTCR複合体を活性化するように設計された工学細胞表面タンパク質を持つヒトCD155を発現するように操作されたCHO-K1細胞である。この2種類の細胞を共培養すると、TIGITはCD226の活性化とプロモーターを介した発光を阻害する。抗TIGIT抗体を添加すると、TIGITとCD155との相互作用が阻害され、あるいはTIGITがCD226のホモ二量体化を阻害し、その結果、プロモーターを介した発光が阻害される（図1）。

CTLA-4遮断バイオアッセイは、2つの遺伝子エンジニアリング細胞株から構成される： CTLA-4エフェクター細胞は、ヒトCTLA-4と、TCR/CD28活性化に反応するネイティブプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを安定的に発現するJurkat T細胞であり、aAPC/Raji細胞は、抗原非依存的にコグネートTCRを活性化するように設計された工学細胞表面タンパク質を発現し、CTLA-4リガンドCD80とCD86を内因的に発現するRaji細胞である。この2つの細胞を共培養すると、CTLA-4はCD28とCD80とCD86という共通のリガンドをめぐって競合し、CD28経路の活性化とプロモーターを介した発光を阻害する。抗CTLA-4抗体を添加すると、CTLA-4とそのリガンドCD80およびCD86との相互作用が阻害され、プロモーターを介した発光が生じる（図2）。

発光アッセイの出力はロバスト性であるため、どちらのアッセイも発光検出モードのあるマイクロプレートリーダーで容易に検出できる。ここでは、Molecular Devices社の複数のマイクロプレートリーダーとこれら2つのアッセイを比較した。SpectraMax® iD3 マルチモードマイクロプレートリーダー、SpectraMax® L マイクロプレートリーダー、SpectraMax® i3x マルチモードマイクロプレートリーダー、SpectraMax® M5 マルチモードマイクロプレートリーダーです。すべてのリーダーはSoftMax® Proソフトウェアを使用して操作しました。このソフトウェアには、EC50応答値の自動計算やデータセットの比較を簡単に行うためのデータ解析およびカーブフィット処理が組み込まれています。

材料

TIGIT/CD155アッセイ

• TIGIT/CD155 Blockade Bioassay (Promega cat. #J2201, J2205)
• コントロールAb, 抗TIGIT (Promega cat. #J2051)

CTLA-4アッセイ

• CTLA-4ブロッケードバイオアッセイ (プロメガ社製 cat. #JA3001, JA3005)
• コントロールAb, 抗CTLA-4 (Promega cat. #JA1020)

その他の材料と器具

• 白色、組織培養処理済み、平底96ウェルアッセイプレート（Corning社のカタログ#3917）
• CO 2インキュベーター、37℃、5% CO2、加湿
• SpectraMax® iD3 マルチモードマイクロプレートリーダー（cat. #ID3-STD）
• SpectraMax® i3x マルチモードマイクロプレートリーダー (cat. #i3X)
• SpectraMax® M5マルチモードマイクロプレートリーダー (cat. #M5)
• SpectraMax® L マイクロプレートリーダー (cat. #SpectraMax L Config)

方法

TIGIT/CD155遮断バイオアッセイ

アッセイ前日、製品テクニカルマニュアルの記載に従ってアッセイバッファーを調製した。Thaw-and-Use TIGIT Effector Cells 1バイアルを解凍し、細胞回収培地に懸濁した。細胞懸濁液を96ウェル白色平底アッセイプレートの内側60ウェルに添加した。プレートを37℃のCO2インキュベーターで一晩インキュベートした。

アッセイ当日、コントロールAbである抗TIGITの連続希釈液を調製し、完全な10点用量反応曲線を作成した。Thaw-and-Use CD155 aAPC/CHO-K1 セルを解凍し、アッセイバッファーに懸濁した。その後、TIGIT Effector セルを封じ込めたアッセイプレートをインキュベーターから取り出した。コントロール抗体の連続希釈液を TIGIT Effector 細胞を含むウェルに添加し、続いて CD155 aAPC/CHO-K1 Cells を添加した。プレートに蓋をし、37℃、5％CO2加湿インキュベーター内で6時間インキュベートした。

CTLA-4アッセイ

アッセイ当日、製品添付文書の指示に従ってアッセイバッファーを調製した。コントロール抗体、抗CTLA-4の連続希釈液を調製し、完全な用量反応曲線を作成した。抗体希釈液は、後でセルに添加するために取っておいた。Thaw-and-Use CTLA-4 Effector Cellsのバイアルを解凍し、アッセイバッファーに懸濁した。細胞懸濁液を96ウェル白色平底アッセイプレートの内側60ウェルに添加し、続いてコントロール抗体の連続希釈液を添加した。

解凍後使用するaAPC/Raji細胞のバイアルを解凍し、アッセイバッファーに再懸濁した。この細胞懸濁液を、CTLA-4エフェクターセルと抗体混合物を既に封じ込め たアッセイプレートの内側60ウェルに添加した。プレートに蓋をし、5％CO2加湿インキュベーター中、37℃で16時間インキュベートした。

Bio-Glo Luciferaseアッセイの検出

アッセイ誘導期間中、Bio-Glo™ Luciferase Assay Bufferを室温に温めた。Bio-Glo™ ルシフェラーゼアッセイシステムは、Bio-Gloバッファー1瓶をBio-Glo™基質の封入された瓶に移して再構成した。

6時間または16時間の誘導後、アッセイプレートを10-15分間室温に平衡化した。等量の再構成Bio-Glo™ 試薬を、セルを封じ込めた各ウェルに添加した。プレー トを室温で5-10分間インキュベートした。発光は、発光検出モードの Molecular Devices マイクロプレートリーダーで、積分時間 1 秒で測定した。

データ解析

正規化RLU値は、各インストゥルメンテーションで得られた最大RLU値を100%とし、それに応じて残りのRLU値をスケーリングすることにより算出した。データは、抗体濃度に対するローデータまたは正規化 RLU としてグラフ化した。EC50 値は、SoftMax Pro ソフトウェアを用いたビルトインデータ解析と4パラメータロジスティックカーブフィット処理により求めた。

結果

6時間または16時間の誘導後、ルシフェラーゼ活性をSpectraMaxリーダーで発光検出モードで測定した。生のRLU値と正規化RLU値を、SoftMax Proソフトウェアで4パラメータカーブフィットを用いてプロットした（図3Aと3B、4Aと4B）。両アッセイとも、SpectraMax Lリーダーが最も高いRLU値を示し、SpectraMax M5リーダーが最も低いRLU値を示した（表1）。RLU値を正規化した結果、すべてのインストゥルメンテーションのデー タは類似していた。すべてのリーダーで、観察されたEC50値は非常に一貫しており、抗TIGIT抗体では1.05～1.31 μg/mLの範囲、抗CTLA-4抗体では1.69～1.82 μg/mLの範囲であった（表1）。

結論

TIGIT/CD155およびCTLA-4 Blockadeバイオアッセイは、生物製剤の作用機序を測定する生物学的に適切な方法をユーザーに提供する。これらのバイオアッセイは、シンプルな添加と測定のワークフローとエンジニアリングエフェクター細胞およびaAPC細胞を組み合わせたものです。このバイオアッセイはシンプルでロバスト性があり、ICH（International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use：国際医薬品規制調和委員会）のガイドラインに従って事前に適格性が確認されており、力価試験や安定性試験でのルーチン使用に必要な精度、正確性、直線性を示している。アッセイの時間枠は様々であり、どのアッセイ時間を使用するかの決定は、ワークフローの好みとは別に、発光アッセイリーダーの感度に依存する部分もある。Thaw-and-Use セルフォーマットでは、細胞培養は不要であり、アッセイは96ウェルまたは384ウェルフォーマットで容易に実施できる。アッセイの発光測定はロバストで再現性が高いため、さまざまなSpectraMax® リーダーでの使用に最適です。迅速で便利なワークフローは、SoftMax Proソフトウェアの自動データ解析とグラフ化によって補われています。

表1. SpectraMaxリーダーで測定したEC50応答。SoftMax® Proソフトウェアで計算したTIGIT/CD155およびCTLA-4遮断バイオアッセイの結果を示す。