Application Note FLIPRカルシウムアッセイキットによる細胞内カルシウム測定の比較

イントロダクション

Gタンパク質共役型受容体（GPCRs）は、細胞シグナリングにおいて重要な役割を果たしています（図1）。受容体がリガンドによって活性化されると、受容体のコンフォメーションが変化し、セル内でGタンパク質の活性化が引き起こされます。活性化されたGタンパク質は、カルシウムを含む様々な細胞内メッセンジャーのカスケードを誘導する可能性がある。FLIPR®システムはハイスループットで機能的な細胞ベースアッセイを行うことができ、蛍光カルシウム感受性レポーター色素を用いて検出される細胞内カルシウムの変化を評価する創薬に最適なシステムです。本アプリケーションノートでは、FLIPRカルシウムアッセイキットを用いたカルシウム動員アッセイの基本的なプロトコールについて説明します。FLIPR Tetra®システムを用いた均一性、迅速性、信頼性の高い蛍光アッセイです。FLIPR Tetraシステムを用いて、Rat Muscarinic Receptor (M1)をトランスフェクトしたCHO M1WT3細胞におけるカルバコールの用量反応を測定します。96ウェルおよび384ウェルのマイクロプレートフォーマットのデータを示す。

材料

• ラットムスカリン（M1）レセプターをトランスフェクトしたCHO M1WT3セル（American Type Culture Collection Cat.）
• 培地 Ham's F12 Media (Irvine Scientific Cat. #9058) 10%, Fetal Bovine Serum (Hyclone Cat. #SH30071.03) 1%, Pen/Strep/Glutamine (Invitrogen, Cat. #10378-016), 50 µg/mL Geneticin (Invitrogen Cat. #10131-035).
• カルシウムとマグネシウムを含まないPBS（Invitrogen Cat.）
• VERSENE ® 1:5000 (Invitrogen Cat. #15040-066)
• トリプシン-EDTA 1X 溶液（Irvine Scientific、Cat. #9341）
• 10X Hank's Balanced Salt Solution（HBSS、Invitrogen Cat.）
• 滅菌水（Irvine Scientific、Cat. #9309）
• HEPES (Invitrogen Cat. #15630-080)
• プロベネシド（Sigma Cat.）
• FLIPR カルシウムアッセイキット（Molecular Devices Cat.）
• AquaMax ® DW4 Dispenser and Washer（Molecular Devices社製）
• FLIPR Tetra蛍光イメージングプレートリーダー（Molecular Devices社製）

方法

セルの調製

ステップ1：アッセイ用の培養液を調製する。CHO M1WT3細胞を1:30に分割し、培地で週2回培養し、37℃、5% CO₂でインキュベートする。

ステップ2：セルプレートを準備する。フラスコ内の細胞単層をカルシウムとマグネシウムを含まないPBSで洗浄する。

ステップ3：フラスコをVERSENE 1:5000（またはTrypsin-EDTA）で37℃、5分間インキュベートし、血清を封じ込めた培養液で軽くすすぎ、フラスコの側面をタッピングして細胞を取り除きます。

ステップ4：細胞を400 x gで5分間遠心する。培地に再懸濁し、数を数える。黒壁透明底マイクロプレートに細胞を播種し、37℃、5% CO₂で一晩培養する。推奨細胞濃度とウェル容量を表1に示す。Molecular Devices社のAquaMax DW4を用いて、1536ウェルマイクロプレートに細胞を分注した。

表 1. FLIPR Tetraシステムを用いたFLIPRカルシウムアッセイキットのプレーティングフォーマットとセル数。

細胞内カルシウム濃度の変化を観察するためには、セルにカルシウム感受性の 蛍光色素を負荷する必要がある。Molecular Devices社のFLIPRカルシウムアッセイキットは、シンプルで信頼性の高い「混合＆測定」形式を採用しているため、色素のロードや洗浄の手順で起こりがちな細胞の剥離やカルシウムシグナルの減弱を大幅に低減または完全に排除することができます。取り込まれなかった細胞外色素からの蛍光シグナルは、特許取得済みのクエンチベース技術（QBT™）により減衰し、高いSB比が得られます。

FLIPR カルシウムアッセイキットのプロトコール

ステップ1：100 mL の 10X HBSS を 880 mL の注射用滅菌水で希釈し、ローディングバッファーの調製を開始する。

ステップ2：20 mLの1M HEPESを加えます。最終濃度は20 mMです。

ステップ 3：250 mM のプロベネシド（PBC）ストック溶液を 5 mL の 1N NaOH と 5 mL のローディングバッファーで調製する。

ステップ 4:96-well および 384-well アッセイでは、ローディングバッファー 98mL に 250mM PBC 2mL を加え、ローディングバッファー + 5mM PBC を調製する。1536ウェルアッセイでは、67mLのローディングバッファーに2.01mLのPBCを加え、ローディングバッファー+7.5mM PBCを調製します。

ステップ 5:pH を 7.4 に調整する。

ステップ6：色素ローディングバッファーを調製するために、ステップ4および5で調製したPBC入りローディングバッファーにバルクキットバイアル1本分を完全に溶解します。10mLのPBC入りローディングバッファーでボルテックスし、まずバイアル内の色素を溶かします。

ステップ7：セルプレートをインキュベーターから取り出し、各ウェルに適切な量のDye Loading Bufferを加えます。推奨量は表2をご参照ください。

注：1536ウェルマイクロプレート用のDye Loading Bufferは、AquaMax DW4 Systemまたは同等品を用いてマイクロプレートに添加します。

表 2. 推奨カルシウムアッセイキット希釈容量。

ステップ 8:プレートを 5%CO₂、37℃で 1 時間、その後室温で 10 分間インキュベートします。

注：アッセイ前にプレーティングは行いません。

ステップ9：インキュベーション後、プレートを直接FLIPR Tetra Systemに移し、カルシウム動員アッセイを開始する。色素調製、セルおよび実験パラメータに関する詳細は、FLIPRカルシウムアッセイキット製品添付文書を参照するか、Molecular Devices Applications Supportまでお問い合わせください。

化合物プレートの調製

細胞内カルシウム測定は、急速に変化する細胞のカイネティクスを可視化するため、迅速に行う必要があります。最適なピペッターの容量、高さ、速度はFLIPR Tetraシステムで簡単に設定できます。細胞単層を乱すことなくリガンドを細胞に供給するため、液量は最終液量の約10-30%が添加されるように調整します。リガンド濃度はそれに応じて調整する。この実験では、96ウェルおよび384ウェルフォーマットでは20％、1536ウェルフォーマットでは14.3％のリガンドを添加する。

注意：溶解にDMSOを必要とするスクリーニング化合物は、アッセイ中の最終濃度が1%以下になるように希釈することを推奨します。

FLIPR Tetraシステムの設定

FLIPRシステムの機能をベースに、FLIPR Tetraシステムのピペットヘッドはユーザーが簡単に交換できるようになりました。使い捨てのピペットチップを使用する96ヘッドと384ヘッドとは対照的に、1536ウェルの液体移送は、ステンレス製カニューレチップブロックとモレキュラーデバイスの新しいエラストマー技術を組み合わせたピペッターヘッドで行われます。ScreenWorks® ソフトウェアはユーザーフレンドリーなインターフェースで、アッセイパラメーターを簡単に設定できます。推奨されるインストゥルメンテーション、設定、アッセイパラメーターの詳細については、『 FLIPR Tetraシステムユーザーガイド』を参照してください。アッセイ容量、高さ、速度は、ウェル底から細胞が外れることなく最適な混合が得られるよう、細胞の種類ごとに実験的に決定されます。CHO M1WT3セルで使用した推奨設定は表3をご参照ください。

表3. FLIPRカルシウムアッセイキットのFLIPR Tetraシステムパラメータ。

結果

アッセイ開始時（すなわち、化合物添加前）に、色素負荷細胞の基底蛍光を確認するために「シグナリングテスト」を実施する。細胞の基底蛍光シグナルは 200～1500RFU が最適です。詳しくはFLIPR Tetraシステムユーザーガイドの「シグナルテストの実行」のセクションを参照してください。FLIPR TetraシステムとFLIPRカルシウムアッセイキットを用いて、カルバコールによるカルシウム動員によって誘発される相対光単位の変化を測定する。

図2は、FLIPR TetraシステムでFLIPRカルシウムアッセイキットを用いて作成した3種類のフォーマットにおけるカルバコール用量反応曲線を示しています。96ウェルおよび1536ウェルマイクロプレートアッセイのEC₅₀は、それぞれ17.9 nMおよび18.0 nMであった。384ウェルマイクロプレートアッセイのEC₅₀は14 nMであった。

蛍光シグナルの最大振幅は96ウェルマイクロプレートで最も大きかった。384ウェルプレートと1536ウェルプレートからの蛍光シグナルは非常に類似していた。

EC₈₀のZ値は、3種類のマイクロプレートとも0.70以上であった。384ウェルでのカルバコールに対する蛍光シグナルのシグナルトレースを図3に示す。

結論

FLIPR Tetraシステムは、96ウェル、384ウェル、1536ウェルフォーマットのリアルタイムカイネティックセルベースアッセイに対応するスクリーニングプラットフォームを提供します。FLIPR Tetraシステムのマイクロプレートプラットフォームを選択しても、本試験で得られたEC₅₀およびZ値から明らかなように、同等の結果が得られる。

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