Application Note FlexStation 3リーダーおよびFLIPR Tetraシステムにおける
Photina発光カルシウム動員アッセイの比較

はじめに

Gタンパク質共役受容体（GPCR）は創薬研究において最も重要な治療標的の一つである。GPCRは細胞膜に局在するタンパク質で、細胞シグナル伝達において重要な役割を果たしている。受容体がリガンドによって活性化されると、受容体の構造が変化し、細胞内のGタンパク質が活性化される。活性化されたGタンパク質は、カルシウムを含む様々な細胞内メッセンジャーのカスケードを誘導する可能性がある。

カルシウム活性化光タンパク質は、哺乳類細胞におけるカルシウムの動員を伴う受容体を介したシグナル伝達イベントを検出するための重要なツールである。光タンパク質の大きな利点のひとつは、カルシウムがコエレテラジン-光タンパク質複合体に結合すると、即座にフラッシュ発光を示すことである。イクオリン測定のバックグラウンドシグナルはゼロに近く、高いシグナル／バックグラウンド比が得られる。さらに、コエレテラジンの酸化によって放出される光は、光励起に依存しないため、自家蛍光の問題がない。

現在では、光タンパク質発現細胞株の商業的供給源が数多くあり、この技術がより広く利用できるようになっている。これらのアッセイ法は文献1や米国特許6,872,538号、欧州特許1,145,002号にも記載されている。特許された方法にご興味のある方は、これらの特許を評価する際に法律顧問に相談されることをお勧めします。

Molecular Devices FlexStation® 3 Multi-Mode Microplate Readerは、蛍光および発光性の細胞ベースのアッセイをリアルタイムで測定できるフルイディクスを内蔵しています。最大8ウェル（96ウェルフォーマット）または16ウェル（384ウェルフォーマット）のウェルを、化合物添加前、添加中、添加後に同時にモニターすることができます。アッセイは、ユーザー定義のディスペンス高さ、化合物添加速度、試薬源の位置、および各添加のチップ選択により、簡単に最適化できます。使い捨てのピペットチップを使用することで、添加と実験間のクロスコンタミネーションの機会を減らし、（インジェクターと比較して）プレートのデッドボリュームを減少させ、貴重な試薬を節約します。

Molecular Devices社のFLIPR Tetra®システムは、GPCRおよびイオンチャネルの活性をモニタリングするための市場をリードする装置であり、創薬プロセスにおいてリード化合物を早期に同定するための信頼性と柔軟性に優れたHTS/uHTSソリューションです。FLIPR Tetraシステムには、蛍光と発光の両方のアッセイに最適化された新しいICCDカメラ技術を搭載したaequorinオプションが加わりました。さらに、細胞浮遊システムにより、96ウェル、384ウェル、1536ウェルフォーマットの接着細胞および浮遊細胞ベースのアッセイに対応します。

このアプリケーションノートでは、FlexStation 3 リーダーとICCDカメラ付きFLIPR Tetraシステムを用いた付着性イクオリンアッセイを実施するための基本プロトコルを示します。両装置を使用して、CHO mito-Photina/H3 細胞における IMETIT の濃度反応を様々な細胞濃度で測定した。

材料

• CHO mito-Photina/H3細胞（Axxam SpA）。H3細胞株は、CHO-K1細胞に、ミトコンドリア膜を標的としたキメラ光タンパク質であるPhotina、Ga16、およびヒスタミンH3遺伝子を安定的にトランスフェクトすることにより作製した。
• 培地 15mMのHEPES（Cat. #11039- 047）、1.35mMのピルビン酸ナトリウム（Cat. #11360-070）、10％のFBS（Cat. #10082-147）、1％のペニシリン／ストレプトマイシン（Cat. #15070-063）、500μg/mLのGeneticin（Cat. #10131-027）、および1％のL-グルタミン（Cat. #25030-081）を添加したダルベッコのMEM／Nutrient Mix F12、すべてInvitrogenより。
• カルシウムとマグネシウムを含まないPBS（Invitrogen Cat.）
• VERSENE 1:5000（Invitrogen Cat. #15040-066）
• DMSO（Sigma Cat.#D5879）および1mMグルタチオン（Sigma Cat.#G-6529）で希釈した11mMのネイティブコエンテラジン（PharmaTech Int. Cat.#55770-48-1）ストック溶液。
• アッセイバッファー フェノールレッドを含まないDMEM/HAM's F12（Invitrogen Cat.#11039-021）と15mM HEPES（Invitrogen Cat.#11039-047）および0.1% BSA（Sigma Cat.#A3294）。
• ヒスタミンH3アゴニスト：IMETIT（Sigma Cat.）
• 384ウェル黒壁透明底マイクロプレート (Corning Cat. #3712)
• ICCDカメラオプション付きFLIPR Tetraシステム（Molecular Devices社製）

• FlexStation 3 マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製）

測定方法

アッセイプレートの調製

アッセイプレートを作成するために、CHO mito-Photina/ H3 細胞を VERSENE を用いて回収し、選択抗生物質無添加の培地に再懸濁し、384 ウェル、ブラックウォール、クリアボトムプレートに 25 µL の細胞濃度（625, 1250, 2500, 5000 cells/well）でプレーティングし、5% CO2、37℃で一晩インキュベートした。

アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、培地を除去し、5μMのネイティブコエンテラジンを含む25μLのアッセイバッファーと交換した。コエリンテラジンを添加したプレートを、暗所で5時間、室温でインキュベートした。

化合物プレートの調製

ポリプロピレン製 384 ウェルプレートを用いて、H3- ヒスタミン受容体アゴニストである IMETIT の 2 倍濃度系列をアッセイバッファー中で調製した。

装置のセットアップとデータ解析

コエレテラジンとのインキュベーション後、アッセイプレートをFlexStation 3リーダーまたはFLIPR Tetraシステムにセットした。プロトコールは、SoftMax® Pro Software（FlexStation 3）または ScreenWorks® Software（FLIPR Tetra）で、それぞれ表1および表2に示すパラメーターを用いて作成した。

表1. FlexStation 3リーダー： フォティナアッセイセットアップパラメーター。

表2. FLIPR Tetraシステム（ICCDカメラオプション付き）： フォティナアッセイセットアップパラメーター

ルミネッセンス測定値は、ベースライン測定値を得るため に15秒間測定され、その後、装置に搭載された流体システム を用いて、異なる濃度の特異的リガンド（IMETIT）を分注し、ルミネッセ ンスの変化を同時にモニターした。平均RLU（max-min）、標準偏差、EC50、EC80におけるZファクターの計算、および濃度応答曲線のグラフ化はすべて、SoftMax Proソフトウェアを用いて行った。FlexStation 3リーダー用の事前設定済みイクオリンアッセイプロトコルは、 SoftMax Proソフトウェアで入手できる。

結果

CHO mito-Photina/H3トランスフェクト細胞におけるIMETIT刺激カルシウムフラックスは、フラッシュ発光を用いてモニターすることができる。発光シグナルは、FlexStation 3 リーダーと FLIPR Tetra システムの両方で、アッセイ中の時間に対する相対発光単位 （RLU）として測定されます。平均RLU（max-min）をIMETIT濃度に対してプロットし、濃度反応曲線（図1、FlexStation 3リーダーのデータ；図2、FLIPR Tetra Systemのデータ）を作成し、EC50値を算出した。

IMETIT EC50およびEC80におけるZ-factorを表3および表4にまとめた。FlexStation 3マイクロプレートリーダーを用いたIMETITの EC50値あ1.81～2.67 nMであったのに対し、FLIPR Tetraシステム（ICCDカメラオプション付） ではEC50値は1.18～3.00 nMであった。どちらの結果も、公表されているEC50値3.43 nMに近い。EC80におけるZファクター値も両装置間で同等であった。

表3. FlexStation 3リーダーを用いたフォティナ固着アッセイ結果の要約。

表4. ICCDカメラオプション付きFLIPR TetraシステムによるPhotina接着アッセイ結果の概要。

結論

FlexStation 3リーダーとFLIPR Tetraシステム（イクオリンオプ ション（ICCDカメラ）付き）を用いて、フォティナ接着 発光細胞アッセイを測定した。FlexStation 3 リーダーとFLIPR Tetraシステム（ICCDカメラオプション付き）のいずれを用いても、接着発光アッセイ用のフォティナ細胞の調製法と処理法は同じである。このことは、得られるデータの相関性 とともに、低スループットのフォティナアッセイにFlexStation 3リーダーを使用することをサポートします。さらに、この装置はハイスループットのスクリーニングを目的としたFLIPR Tetraシステムに簡単に移行できるアッセイ法の開発にも使用できる。

謝辞

本研究のためにフォティナ細胞株を提供してくれたAxxam社に感謝するとともに、データを快くレビューしてくれたAxxam社のSabrina Corazza氏とSilvia Bovolenta氏に感謝する。また、FLIPR Tetra Systemアッセイを手伝ってくれたLaurence Monnet、加藤真紀、Kristin Prasauckas、Irina Osetinsky、Kasia Paczynaに感謝する。

参考文献

1. Boie, et al., Eur J Pharmacol 340(2-3):227-241 (1997).
   
   

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