Application Note CatchPoint cGMP蛍光アッセイキットを用いた
完全なcGMPワークフローソリューション

イントロダクション

この研究では、CatchPoint® cGMP Fluorescent Assay KitとSpectraMax® i3 MultiMode Detection Platformを組み合わせることで、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）で処理したRFL-6細胞のcGMPを測定できることを実証します[1, 2]。図1のアッセイワークフローをご参照ください。

セカンドメッセンジャーである3', 5'環状グアノシン一リン酸（cGMP）とその関連タンパク質は、平滑筋弛緩、血管拡張、腎機能、光伝達、陰茎勃起などの生理的反応の制御に不可欠であることが示されている[3-7]。

多くの脊椎動物に見られるホルモンであるANPは、cGMPを介してシグナルを送り、腎臓からのナトリウムと水分の排泄を促し、血管平滑筋を弛緩させることによって血圧を下げる [8, 9]。ANPが受容体に結合すると、GTPがcGMPに変換され、プロテインキナーゼGが活性化され、生物学的に関連する多くの標的が活性化される。

CatchPoint cGMP Fluorescent Assay Kitは、競合イムノアッセイによりcGMPレベルを測定する（図2）。アッセイに必要なのは1回の洗浄工程のみで、測定は基質添加後わずか10分、あるいは24時間以内に行うことができる。

材料

• CatchPoint cGMP Fluorescent Assay Kit（Molecular Devices社のカタログ番号R8074）
• RFL-6ラット肺線維芽細胞（ATCC cat. #CCL-192）
• F-12K培地（Kaighn's Modification of Ham's F-12培地、ATCC cat.#30-2004）
  • ウシ胎児血清 (Gemini Bio-Products cat. #100-106)
  • ペニシリン-ストレプトマイシン（Life Technologies社のカタログ番号15070-063）
• クレブス-リンゲル炭酸水素緩衝液（KRGB緩衝液、Sigma cat.#K4002）
  • 炭酸水素ナトリウム (Sigma, cat. #S5761)
• ウシ血清アルブミン（Sigma cat. #9048-46-8）
• リン酸緩衝生理食塩水（PBS、Life Technologies社、cat. #10010）
• ヒトANP (Sigma cat. #A-1663)
• ホスホジエステラーゼ阻害剤、3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX、Sigma cat.#I7018）
• 3％過酸化水素（H 2 O 2 ）溶液
• 96ウェル、透明底、組織培養処理済みマイクロプレート（Corning社製 cat.#3603）
• SpectraMax i3 マルチモードマイクロプレートリーダー
• SpectraMax® MiniMax™ 300イメージングサイトメーター

方法

RFL-6細胞を完全培地（F-12K培地＋20％FBS＋1％pen/strep）で90％以上コンフルエンスまで培養した。細胞を0.05%トリプシンで回収し、組織培養処理した黒壁透明底96ウェルマイクロプレートに20,000細胞/ウェル（15,000～50,000細胞/ウェルが許容範囲）で播種した。細胞は、5% CO₂、37℃のインキュベーターで少なくとも18時間接着させた。

アッセイ当日、SpectraMax® MiniMax® 300イメージングサイトメーターの透過光チャンネルとStainFree™ Cell Detectionテクノロジーを用いて細胞コンフルエンスを測定し、品質管理の目的で細胞数または細胞で覆われた面積（コンフルエンス）を正確に測定した。細胞コンフルエンスが高く、ウェル間のばらつきが少ないセル列を CatchPoint アッセイ用に選択した（図 3）。細胞を、0.75 mM IBMXを封じ込めたKRBG緩衝液で、室温で10分間インキュベートした。次に、セルをANPで1 µMから37℃で15分間、1:3希釈系列で処理した。処理後、CatchPoint assayのプロトコールに従ってセルを溶解した。

CatchPoint アッセイは、製品添付文書に記載されているとおりに実施した。アッセイ性能を検証し、細胞アッセイサンプル中のcGMP量を算出する手段を提供するために、cGMPキャリブレーター曲線を実施した。サンプルは、StopLight Red基質添加の60分後にSpectraMax i3 MultiModeマイクロプレートリーダーで読み取った。すべてのデータ解析とカーブフィッ ト処理は、SoftMax® Proソフトウェアで行いました。事前に設定されたプロトコールは、ソフトウェアのプロトコールライブラリーで利用可能です。

結果

細胞の前刺激および処理前のコンフルエンスを評価するため、MiniMaxサイトメーターとStainFreeテクノロジーを用いて、マイクロプレートの異なる列間の細胞コンフルエンスパーセントを比較した（図3）。ウェル間のコンフルエンスが一定であったため、B列をアッセイに選んだ。各処理ウェルからトリプリケートサンプルを採取し、アッセイした。

図4と図5は、CatchPoint cGMPキャリブレーター曲線とANP応答細胞ベースアッセイの結果を示している。どちらの曲線も、SoftMax Pro ソフトウェアの 4パラメータカーブフィットを使用して作成されました。キャリブレーター曲線のEC₅₀は3.1 nMで、既報のデータとほぼ一致した。Z'ファクターは0.82であった。

RFL-6細胞で観察されたANP濃度応答は、EC₅₀が41 nMであり、これも既報の結果と一致した。

結論

CatchPoint Cyclic GMP Fluorescent Assay Kitは、細胞ベースアッセイにおけるcGMP測定のための正確でロバスト性の高いキットである。本アッセイの高輝度シグナル安定性（基質添加後 10 分～24 時間で読み取り可能）、優れた Z'ファクター、蛍光強度検出モードのあるプレートリーダーでの測定が可能であることから、本アッセイはハイスループットなスクリーニングに多用途に使用できます。SpectraMax MiniMax® 300イメージングサイトメーターとStainFree分析により、細胞ベースアッセイの品質管理がさらに向上します。

以下のMolecular Devices製システムと互換性があります。

参考文献

• Pollock, Jennifer S., et al. "Purification and characterization of particulate endothelium-derived relaxing factor synthase from cultured and native bovine aortic endothelial cells.". Proceedings of the National Academy of Sciences 88.23 (1991)： 10480-10484.
• Schmidt, H. H., et al. "Purification of a soluble isoform of guanylyl cyclase-activating-factor synthase". Proceedings of the National Academy of Sciences 88.2 (1991)： 365-369.
• cGMP、グアニル酸シクラーゼ、cGMP依存性プロテインキナーゼの小史 - 2009 - Alexander Kots + Ferid Murad
• Denninger, John W., and Michael A. Marletta. "グアニル酸シクラーゼと.NO/cGMPシグナル伝達経路". Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics 1411.2 (1999)： 334-350.
• Fesenko EE, Kolesnikov SS, Lyubarsky AL. 網膜桿体外分節の細胞膜におけるカチオン伝導のサイクリックGMPによる誘導。Nature. 1985;313:310-3.
• Brown, R. Lane, et al. "The pharmacology of cyclic nucleotide-gated channels: emerging from the darkness.". Current Pharmaceutical Design 12.28 (2006)： 3597.
• Schmidt, Harald HHW, Suzanne M. Lohmann, and Ulrich Walter. "一酸化窒素とcGMPのシグナル伝達系：制御と作用機序" Biochimica et Biophysica et Biophysica 12.28: 2006. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Cell Research 1178.2 (1993)： 153-175.
• de Bold, Adolfo J. "心房性ナトリウム利尿因子：心臓で産生されるホルモン". Science 230.4727 (1985)： 767-770.
• Leitman, Dale C., et al. "Atrial natriuretic peptide binding, cross-linking, and stimulation of cyclic GMP accumulation and particulate guanylate cyclase activity in cultured cells.". Journal of Biological Chemistry 263.8 (1988)： 3720-3728.

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