Application Note 複雑な生物製剤アッセイにおける
感度、スピード、アッセイ品質の向上

はじめに

オクサナ・シレンコ博士｜シニアリサーチサイエンティスト｜モレキュラーデバイス
ジェイン・ヘスレー｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス
マット・チャン｜光学エンジニア｜モレキュラー・デバイス

生物学研究における高度に複雑な細胞ベース2Dおよび3Dアッセイの使用増加に伴い、自動ハイコンテントイメージングの機能向上が急務となっている。ここでは、ImageXpress® Confocal HT.aiハイコンテントイメージングシステムによるアッセイの感度、品質、取得速度の向上を実証する。高輝度レーザー光源を使用するこのイメージングシステムは、サンプルへの光スループットを大幅に向上させ、その結果、画像が明るくなり、感度が向上し、アッセイのスループットが向上しました。この効果は、感度とイメージング時間が制限要因となるアッセイにおいて特に重要である。レーザー光源の実用的な効果を実証するために、GPCR活性化アッセイ、ガンスフェロイド、肺オルガノイドなど、いくつかの複雑な生物製剤アッセイシステムの結果を紹介する。

方法

ImageXpress® Confocal HT.aiシステムは、励起波長405 nmから730 nmのマルチラインレーザー光源を搭載しています。この光源は、前世代のLED光源と比較して、サンプルへの照射パワーが飛躍的に向上している。

以下に示す例では、ImageXpress® Confocal HT.aiシステムと前世代のImageXpress® Micro Confocalシステムとの比較を行った。

セルアッセイ

Transfluor®アッセイは、活性化時に目的の受容体と会合するGFPタグ付きβアレスチンを発現するセル株を用いて、既述のように実施した1。細胞をイソプロテレノールで刺激すると、用量依存的に凝集した内在化レセプター（ピット）が出現し、20X Plan Apo対物レンズ（60'スピニングディスク）を用いてFITCチャンネルで可視化した。

3Dスフェロイドは、HTC116結腸癌細胞株（ATCC）から、U底低付着性（Corning）マイクロプレートを用いて、既述のように形成した2（Sirenko, 2015）。スフェロイドを抗がん剤で48時間処理し、固定した後、DRAQ5、HCS CellMask OrangeまたはAF555 Phalloidin、Whole Cell GreenまたはAF488 Phalloidin（Thermo Fisher Scientific）で染色した。スフェロイドを20X Plan Apo対物レンズで3D画像化した（5μmステップのZシリーズ）。細胞解析は、MetaXpress® ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェアの最大投影画像で行った。

3Dオルガノイドは、初代ヒト肺上皮細胞（ScienCells）から、Stem Cell Technologies社のキットとプロトコール3. 成熟した肺オルガノイド（発生6週間後）を固定し、Hoechst、MitoTracker Orange、AF488 Phalloidinで染色した。オルガノイドを10倍の倍率で3D画像取得し（深さ150-250μmの範囲をZ-stack画像取得）、MetaXpress 3D画像解析ツールを用いて画像を解析した。

測定結果

GPCR活性化アッセイ、Transfluor

Gタンパク質共役型受容体は、生物学的スクリーニングアッセイにおいて主要な役割を果たす医薬ターゲットの最大のクラスである。Transfluorアッセイは、活性化された目的の受容体と会合するGFPタグ付きβ-アレスチンの内在化を定量します。この内在化の結果、小さな蛍光ピットが出現し、ハイコンテントイメージャーによってカウントされ、特徴付けられる。ピットは比較的暗く、LED光源による1秒間の露光が必要である。ImageXpress® Confocal HT.aiシステムのレーザー光源は、露光時間を3～4倍短縮し、それに対応してイメージング時間を33％短縮した（アッセイ速度は1.5倍向上）。さらに、アッセイZ'値も約20％増加した。

3Dがんスフェロイド

つ目のアッセイでは、標準イメージングシステムImageXpress ConfocalのLED励起とレーザー励起を比較した。HCT-116スフェロイドを丸底プレートで4日間成長させ、最後の2日間、一部のウェルに5μMのサイトカラシンDまたはノコダゾールのいずれかで抗がん化合物処理を行った。スフェロイドを固定し、DRAQ5（核）、Whole Cell Green、Alexa Fluor 555 Phalloidin（アクチン）、またはDRAQ5、HCS CellMask Orange（細胞全体）、Alexa Fluor 488 Phalloidin（アクチン）で染色した。Zシリーズ画像は、20X Plan Apo対物レンズでスフェロイド深度150μmまで取得した（5μmステップサイズで31ステップ）。最大プロジェクション画像で画像解析を行い、核を数え、スフェロイド面積を決定した。LED励起でもレーザー励起でも、14ビットの画像が得られる露光で撮影した。各光源の露光時間を個別に最適化することで、3Dスフェロイド画像取得は、収集するチャンネル数や使用する蛍光色素にもよるが、レーザーを使用した場合とLEDを使用した場合の約半分の時間で行うことができた。

3D肺オルガノイド

肺オルガノイド培養は、初代肺上皮細胞から開始し、Stem Cell Technologies社の試薬とプロトコルを用いてマトリゲルドーム中で増殖させた。簡単に言えば、細胞はまず2Dで拡大され、次に成長因子を減少させたマトリゲルと混合され、24ウェルプレートやその他のプレートフォーマットのマトリゲルドームにプレーティングされた。オルガノイドは疾患モデリングや化合物効果の評価に非常に有用なツールである。オルガノイドの自動イメージングと解析は、オルガノイドにおける表現型の変化を定量的に評価し、オルガノイド実験のスループットを向上させるための重要な手法である。共焦点イメージングと3D画像解析は、3D生物学の複雑な画像を捉えるのに特に有用である。

我々は、3Dオルガノイドサンプルのイメージングにおけるレーザーの影響を評価した。オルガノイドは、複雑な空洞と小胞構造を持つ球状の対物レンズで構成され、10倍から40倍の倍率でマトリゲルを介して20から30のZプレーンを用いてイメージングした。オルガノイドは肺組織を損傷することが知られている化合物で処理し、ミトコンドリア、細胞骨格、細胞接合部を可視化するマーカーで染色した。3Dの体積測定を行い、オルガノイドとオルガノイド内の細胞をカウントし、特徴を明らかにした。対物レンズの高輝度化、高解像度化、鮮明化により、より質の高い解析が可能になった。重要なことは、総露光時間が8倍短縮されたため、イメージング速度が2.3倍向上したことである（51～57％の時間短縮）。

アッセイ速度とスループットに対するレーザー光源の影響
ハイコンテントスクリーニングアッセイのアッセイスピードとスループットに対するレーザーの影響を検証するために、5人の科学者による10種類の独立したアッセイの露光時間と画像取得スピードを比較しました。以下のデータは、これら10のアッセイで観察された露光時間の短縮とスピードアップ（時間短縮）を示している。

結論

レーザー光源の照射パワーは、画像強度とアッセイ感度を大幅に向上させる。レーザーを用いたイメージングシステムは露光時間を大幅に短縮し、イメージング速度とアッセイ処理能力を向上させた。3Dイメージングは特にレーザー光源の恩恵を受けた。いくつかの生物学的アッセイを特性評価し、高輝度画像と画質の向上を実証した。

1. Transfluor, MolDev https://www.moleculardevices.com/en/assets/app-note/dd/img/gpcr-activation-using-metaxpress-acuityxpress-software-and-transfluor-assay-system
2. Sirenko et.al., 2015, Assay and drug development technologies https://www.liebertpub.com/doi/pdfplus/10.1089/adt.2015.655
3. 幹細胞テクノロジー、https://www.stemcell.com/pneumacult-airway-organoid-kit.html