Application Note 生存率への影響を最小限に抑えたカルセインAMを用いて、
クローナリティを確実に保証

要旨

クローナリティーの評価は細胞株樹立の鍵であり、バイオ医薬品を上市するためには、規制当局から単クローン性の証拠が要求される。伝統的で最も受け入れられているアプローチは、0日目に透過白色光（明視野）を用いてマイクロプレートウェルを可視化し、単一細胞の存在を確認することである。しかしながら、細胞播種初日に単一細胞を確実に同定することは、細胞残渣やウェルのアーチファクトが細胞と間違えやすいため、困難が伴います。ここでは、蛍光試薬であるカルセインAMと、蛍光を発することのできるCSIを併用した最適化されたワークフローを示す。このワークフローでは、クローンアウトグロースへの細胞毒性影響を最小限に抑えながら、蛍光対応CloneSelect™ Imagerで単一細胞を検出するのに理想的なカルセインAM濃度を決定する。さまざまな細胞タイプに最適な生存率色素濃度を設定するためのガイドラインについて説明します。

はじめに

目的の特定タンパク質を発現する細胞株の開発は、生物製剤の生 産に不可欠であり、規制当局は生物製剤を市場に出すため に、単クローン性の証拠を要求する。伝統的なアプローチでは、0日目に透過白色光を用いてウェルを可視化し、単一細胞の存在を確認する。しかし、このアプローチは、細胞の残骸やウェル のアーチファクトが細胞と間違えやすいため、問題がないわけでは ない。そのため、細胞株開発者は通常、コロニーの状態で細胞を評価し、コロニーの起源をさかのぼって単クローン性を確認する。

別の方法として、単一細胞を播種する前に細胞集団を蛍光標識する方法がある。ここでは、生細胞の膜を透過して初めて緑色に蛍光を発する分子である、生存能力色素カルセインAM（CAM）を用いて、単一細胞の検出をより簡単に自動化すると同時に、クローン性をより確実に立証する。透過型白色光（WL）を用いたワークフローと、WLと蛍光（FL）の両方を用いたワークフローとの違いについて概説する。

研究結果

単一細胞の検出に最適なCAM濃度の決定

信頼性の高い標識プロトコルを開発する上で重要なパラメーターは、検出のために細胞が十分に標識されていることを確認することである。同一の染色条件下で、3種類のCAM濃度（0.5μM、1μM、5μM）を比較した。5μMと1μMのCAMでは大部分の細胞が検出可能であるが、0.5μMでは検出できないことが観察された。濃度は特定の細胞タイプと染色プロトコールに依存するが、最適な染色範囲を決定するために同様の希釈系列を実施できることに注意。

コロニー伸長に対するCAMの効果の評価

生きた細胞を染色する蛍光プローブは、細胞の生存率に悪影響を及ぼすことで有名である。そのため、0.5μM、1μM、5μMのCAMが限界希釈後のアウトグロースに及ぼす影響を試験した。5μMでは、伸長率の低下が観察された。これに対し、0.5μM、1μM、および標識無しのコントロールでは、生シングルコロニーアウトグロースの数に明確な差は見られなかった。

結論

• 蛍光を発するCloneSelect Imagerシステムを用いて、カルセインAM蛍光生存率色素を用いた最適化されたワークフローが示され、ラベルフリー条件と同様の生存率を示すと同時に、クローナリティの高い保証が得られた。
• 1μMのカルセイン-AMは、CloneSelect Imagerで単一細胞を検出するのに理想的であり、同時に細胞毒性を誘発しなかった。他の色素、細胞タイプ、イメージング・システム、および他の実験条件についても、同様のアッセイ最適化ステップが必要であろう。
• 単クローン性を確認するための蛍光アプローチは、単一細胞を手作業で同定するのに必要な時間を短縮する上で非常に有益です。分析は0日目に即座に実行でき、ワークフローの早い段階でクローナリティに関する情報を提供する。