Application Note CloneSelect Imagerを用いた半固形培地で培養した
モノクローナルCHO-S細胞の確実な同定
- 超高速イメージングによるモノクローナル細胞株の迅速な同定
- 固定化された単一細胞の成長を確実に追跡
- 半固体または液体培地中の単一細胞を、実験的柔軟性をもってイメージング
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はじめに
生物学的医薬品の承認を得るための規制基準は常に進化している。生物学的細胞株の規制基準のひとつである単クローン性のデジタル文書化は、バイオプロセスにおいてより堅牢な技術と方法論の必要性を高めています。多くの研究者は現在、CloneSelect™ Imager などのイメージングシステムを日常的に使用して、単クローン性を確認し、液体細胞培養培地での細胞増殖をモニターしています。しかし、CloneSelect Imagerは、静止したままの半固形培地で増殖した細胞を画像化する柔軟性も備えているため、研究者は同じ細胞を長期間にわたって画像化していることを確信することができます。
従来、細胞のクローニングには限界希釈法が用いられてきた。しかし、この方法は液体培地を使用するため、通常の細胞培養プレ ートの取り扱いではウェル内で浮遊細胞が動いてしまい、細胞増殖の 追跡が困難になることがある（図1）。このような細胞の動きは、同じ細胞が撮像され ているという信頼性を低下させる。限界希釈法では、ウェルに複数の細胞が播種される可能性もあ り、高い確率で単クローン性を得るためには、さらにサブクロー ニングを行う必要があるかもしれない。
図1：96ウェルプレートにCHO-S細胞を限界希釈播種した際の同一ウェルの画像。同日、8時間間隔でプレートをCloneSelect Imagerで撮像。プレートを日常的に扱うだけで、細胞はすでにスキャン間で移動しています。黄色の円は細胞の位置を示す。
半固体培地での細胞増殖は、クローニングや細胞増殖の追跡のための、より迅速で容易なソリューションを研究者に提供する。半固体培地で培養された細胞は固定化され、日常的な取り扱い中に細胞が移動するのを防ぐと同時に、細胞が増殖してクローン性のコロニーを形成するのを可能にする。このため、同じウェルに多数の細胞を播種しても、細胞を経時的に画像化することで単一細胞の伸長を明瞭に観察することができ、単クローン性のデジタル検証と成長追跡の両方が可能になります。
CloneSelect Imagerは、半固形培地中の細胞をイメージングするためのターンキーソリューションを研究者に提供します。CloneSelect Imagerは、非侵襲的でラベルフリーのイメージングシステムであり、細胞増殖の客観的かつ定量的な評価と、安定したクローン細胞株のみが下流の研究に選択されることを確実にする単クローン性の検証を可能にします。このアプリケーションノートでは、さまざまなCHO宿主細胞株の増殖を促進するために特別に調製された半固形培地であるCloneMedia™ CHO Growth Aで増殖させた懸濁適応CHO-S細胞を画像化するために、CloneSelect Imagerでこれらの機能を実験的に実証します。
ワークフロー手順
CHO-S細胞の培養とイメージングのワークフローを図2に示す。
図2：クローンメディアCHOグロースA培地における単一細胞の伸長追跡の概要。XP Media CHO Growth AとCloneMedia CHO Growth Aは、CHO細胞の培養、クローニング、スクリーニングのための強固な方法を可能にします。CloneSelect Imagerで撮影した画像は、単クローン性の確認と細胞増殖の追跡を可能にします。
CHO-S細胞の培養
CHO-S細胞は、まず4mM L-グルタミンを添加したXP Media™ CHO Growth A液体培地（カタログ番号K8860）で培養し、37℃でインキュベートした。その後、CHO-S細胞をクローンメディアCHOグロースA半固形培地（カタログ# K8810）に50,000個および500個/mLの密度で播種した。CHO-S細胞とCloneMedia CHO Growth Aの混合物を6ウェルプレート（Greinerカタログ# 657185）に2mL/ウェルの容量でピペッティングした。直径10μMの非滅菌ビーズ（Thermo Scientificカタログ# G1000B）も半固形混合物に加えた。これらのビーズは、CHO細胞半固形培地ワークフローには必要ない。ビーズは、画像の目印となる。
ウェルA1に50,000細胞/mLを2mL播種し、CHO-S細胞の大部分が存在する焦点位置を決定した。残りのウェルには500細胞/mLを2mL播種した。その後、プレートを200 x gで5分間遠心し、37℃でインキュベートした。
CHO-S細胞イメージング
Plate は CloneSelect Imager を用いて画像化した。CHO-S細胞は、単クローン性をデジタルで証明し、細胞増殖を追跡するために、複数の時点で画像化した。各プレートは、0日目、1日目、2日目、7日目、8日目に画像化した。Day0では、撮像前にプレートを37℃で4時間インキュベートした。0日目には、ウェルA1でオートフォーカスを使用し、プレート内の全ウェルの適切な焦点位置を決定した（図3）。この焦点位置は、その後の残りの時点の画像に使用された。
図3：CloneSelect Imagerのフォーカス設定。(A) 6ウェルプレート内のCHO-S細胞の画像化に使用したCloneSelect Imagerのフォーカス設定。フォーカスの設定にはオートフォーカス機能を使用した。(B) オートフォーカス設定を使用したウェルA1の画像例。
結果
CloneMedia CHO Growth Aで増殖させたCHO-S細胞は、同定が容易なコンパクトな球状コロニーを形成した。500細胞/mLで播種したウェルは、8日目に個々のコロニーを観察できる密度であった（図4Aおよび4B）。半固形培地を使用することで、一つのウェルで複数の異なるコロニーを生育させることができ、限界希釈と比較して、より少ないプレートと少ない培地で同じ数のコロニーをスクリーニングすることができる。
図4：CloneSelect Imagerで撮影した、クローンメディアCHO増殖A培地中のCHO-S細胞。(A) 500 cells/mLの密度で播種したCHO-S細胞のホールウェル画像。8日目にCloneSelect Imagerを用いてCHO-S細胞を撮像した。(B）ウェルの一部を拡大すると、明瞭なコロニーが認められる。(A)の黄色い円は、(B)に示すウェルの領域を示す。
CloneSelect Imagerソフトウェアを使って固定化した個々のコロニーを拡大することにより、成長を追跡し、異なる時点のコロニー画像を確認することにより、コロニーが単クローン性であるかどうかを判断することができる。図5に、2つのコロニーの画像を示す。つのコロニーの成長を観察し、0日目までさかのぼって画像を追跡することで、コロニーが1つまたは複数の細胞に由来するかどうかを決定することができる。半固形培地へのビーズ（黄色の丸で示す）の添加は、毎回同じコロニーを撮 影していることを確認するための位置参照として役立つ。
図 5：CloneMedia CHO Growth A 半固形培地における CHO-S 細胞の増殖。CloneSelect Imagerを使用して、6ウェルプレートから複数の時点で画像を取り込んだ。0日目には、上部に1つの細胞が存在し、下部には2つの細胞が観察されることが明瞭に観察される。黄色の丸は、同じコロニーが経時的に撮像されていることを確認するための位置基準となるビーズの位置を示す。
| 製品 | 概要 | カタログ番号 |
|---|---|---|
| クローンメディア CHO グロース A with L-Gln | (1 x 90 mL | K8810 |
| クローンメディア CHO グロース A (L-Gln 含有) | 6 x 90 mL | K8800 |
| クローンメディア CHO グロース A（L-Glnなし） | 1 x 90 mL | K8840 |
| クローンメディア CHO グロース A L-Glnなし | 6 x 90 mL | K8830 |
| XP メディア CHO グロース A | 1000 mL | K8860 |
| CloneSelect Imager | 細胞増殖の客観的かつ定量的な評価と単クローン性の検証のためのラベルフリーイメージングシステム | お問い合わせ |
結論
クローンメディアCHOグロースAでCHO細胞を培養することは、液体培地で限界希釈を行うよりも効率的なクローニング方法です。半固体培地は細胞を固定化し、日常的な取り扱い中に細胞が動くのを防ぎます。これにより、研究者は単一細胞からコロニーへの成長を確実に追跡することができます。CloneSelect Imagerは従来、液体培地中の細胞を画像化するために使用されてきましたが、半固体培地中で増殖した細胞を画像化する機能も備えているため、単クローン性を判定するだけでなく、細胞の増殖をモニターするツールにもなります。
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