Application Note カイネティック-QCLカイネティック発色
LALアッセイによるエンドトキシンの検出

はじめに

Joyce Itatani | Application Scientist | Molecular Devices
Cathy Olsen, PhD | Sr. Applications Scientist | Molecular Devices

汚染物質のモニタリングは、製薬および医療機器産業における製造プロセス中の重要なステップである。頻繁に発生する汚染物質であるエンドトキシンは、発熱、炎症、頭痛、吐き気、そして死に至ることさえあります。グラム陰性菌の細胞壁に存在するエンドトキシンは、感度が高く特異性の高い細胞溶解液（LAL）アッセイによって日常的に検出されています。エンドトキシンの存在下では、LALは酵素を介したカスケードによって凝固し、ゲル化と濁度に基づいて定量されてきました。

Lonzaのカイネティック-QCL™ キネティック発色LALアッセイは、LALエンドトキシン反応の初期部分を利用し、合成基質からp-ニトロアニリン（pNA）を遊離する酵素を活性化し、405nmの吸光度によって検出される黄色を生成します。この発色アッセイの出力は、比濁アッセイで凝固機構を阻害する可能性のある阻害生成物の検査に適しています。この吸光度は吸光マイクロプレートリーダーで測定でき、サンプル中のエンドトキシン濃度に比例します。ここでは、SpectraMax® Miniマルチモードマイクロプレートリーダーがエンドトキシン定量にどのように使用できるかを紹介します。

材料

• カイネティックQCL
• ™
• Kinetic Chromogenic LAL Assay (Lonza cat. #50-650U)には以下の試薬が含まれます：
  ・カイネティックQCL試薬
  ・LAL試薬水
  ・ 大腸菌 O55:B5 エンドトキシン（本キットのコントロール標準エンドトキシン）
• 96-well 透明 LAL 試薬グレードマルチウェルプレート（Lonza 社製 cat.）
• パイロジェンフリー希釈チューブ（Lonza cat.）
• SpectraMax ミニマルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製 CAT 
  cat. #SMAX MINI AFL、SMAX MINI AF、またはSMAX MINI AL)

方法

アッセイをセットアップする前に、SpectraMax MiniリーダーをSoftMax Proソフトウェアのユーザーインターフェースを介して37℃に加温した。

コントロール標準エンドトキシンを、キットに同梱されている分析証明書に記載されている通り、LAL 試薬水（LRW）で再構成し、50 EU/mL の溶液を得た。バイアルを15分間激しくボルテックスした。カイネティックQCL試薬をキットの説明書に従ってLAL試薬水で再構成しました。バイアルは発泡しないように静かに振り混ぜた。

一連のエンドトキシン標準物質を、使い捨てのエンドトキシンフリーガラス希釈チューブに調製した。5 EU/mL から 0.005 EU/mL までの 1:10 希釈系列を LRW で作製した。LAL 試薬グレードマルチウェルプレートの各ウエルに各標準を 100 µL ずつ添加した。マイクロプレートを予熱したSpectraMaxマイクロプレートリーダー内で37℃で10分間インキュベートしました。次に、マルチチャンネルピペッターを用いて、エンドトキシン標準物質を封じ込めたマイクロプレートのウェルにカイネティックQCL試薬を100μL分注した。SoftMax Proソフトウェアで事前に設定したプロトコルを用いて、表1に示す設定でカイネティック測定を直ちに開始した。405 nmの吸光度データを1分ごとに2時間取得し、ソフトウェアのプレートセクションにリアルタイムで表示した。間隔と実行時間は必要に応じて調整できる。

表1. SpectraMax MiniリーダーでのLAL Kinetic-QCLアッセイのインストゥルメンテーション設定

SoftMax Proソフトウェアで自動データ削減を行い、各ウェルのオンセット時間（反応時間とも呼ばれる）を算出した。オンセット光学濃度（OD）は、キットのマニュアルに示されているように0.2に設定した。オンセット時間とは、ウェルの吸光度が指定されたオンセットOD、すなわち0.2吸光度単位分増加するのに必要な時間である。オンセット時間対標準濃度をプロットし、対数標準曲線を作成した。

結果

0.005～5EU/mLを図1に、オンセット時間を赤の縦線で示した。SoftMax® Proソフトウェアのlog-logカーブフィットを用いて、各標準物質の平均オンセット時間を標準物質濃度に対してプロットした（図2）。

図2. エンドトキシン標準曲線。SoftMax® Proソフトウェアのlog-logカーブフィット処理を用いて、平均発症時間（秒）対エンドトキシン標準濃度をプロットした（n = 2, r2 = 0.987）。

LALカイネティック-QCLアッセイマニュアルによると、性能要件は以下の通りです：

• 算出された標準曲線の相関係数（r）の絶対値が0.980以上であること。
• 計算された標準曲線の相関係数（r）の絶対値が0.980以上であること。標準反復のオンセット時間の%CVが10%未満であること。

SpectaMax Miniリーダーを用いて作成した標準曲線について、SoftMax Proソフトウェアはr2値0.987を算出し、このアッセイの要件を上回った。ソフトウェアが算出した二重標 準の%CV は、各標準で 4%未満でした（表 2）。

表2. SoftMax® Proソフトウェアの標準群テーブルで計算された値。各標準物質の%CVは10以下であり、LALカイネティックに示された必要な再現性を満たしています。

注：SpectraMax ABS ABS Plusマイクロプレートリーダーを使用しても同等の結果が得られました（データは示していません）。

結論

SpectraMax MiniリーダーとLAL KineticQCLアッセイが、検体中のエンドトキシンの検出に適していることが、複製間のばらつきが少なく、アッセイに記載された検出下限値までの感度を持つ直線標準曲線の作成によって実証されました。SoftMax Proソフトウェアは、サンプルのオンセット時間に基づいて、未知検体のエンドトキシン濃度を標準曲線から自動的に補間することができます。