Application Note SpectraMaxマイクロプレートリーダーでの
KASPジェノタイピングテクノロジーによるSNP検出

Young Mee Yoon｜フィールドアプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

はじめに

ジェノタイピングとは、DNA配列を調べることにより、個体間の遺伝的差異を分析するプロセスである。ジェノタイピングには多くの方法があり、研究者はヒト、微生物、植物におけるゲノムの多様性を調査することができる。一塩基多型（SNP）は遺伝的多様性の最も一般的なタイプの一つであり、特異性遺伝子座における一塩基の変異からなる。SNPジェノタイピングは、様々な生物種における疾患関連変異の同定に非常に有用であることが証明されており、その結果、SNP検出のための多くの技術が開発されてきた¹。

Kompetitive Allele Specific PCR (KASP)はSNPジェノタイピングに最も広く用いられている手法の一つであり、その精度の高さ、コスト効率の良さ、アッセイデザインの柔軟性の高さが評価されている。KASPは2つの対立遺伝子特異的フォワードプライマーと1つの共通リバースプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により標的DNA配列を増幅し、反応産物をその配列に対応する蛍光色素で標識する。サンプルがホモ接合体の場合、PCR産物は蛍光色素HEXまたはFAMのみで標識されるが、ヘテロ接合体の場合はHEXとFAMの両方で標識された産物が存在する。取り込まれなかった蛍光色素はクエンチされる^{2, 3} 。KASPアッセイはマイクロプレートフォーマットで行われ、結果は蛍光マイクロプレートリーダーを用いて検出することができる。

このアプリケーションノートでは、LGC Genomics社のKASPアッセイ検証キットを使用して、SpectraMaxマイクロプレートリーダーをどのようにKASP最終産物の読み取りに使用できるかを示します。

最初の実験では、リーダーがFAM、HEX、FAM/HEXを含む各フルオロフォアに特徴的なシグナルを発生することを検証した。2回目の実験では、ベンダーから提供された既知のDNAサンプルを用いてKASPアッセイを行い、PCR産物をリーダーで検出し、サンプルのジェノタイピングが正しいことを確認した。

材料

• 標準 ROX バリデーションキット（LGC Genomics 社製 KBS-1014-101）
• サーマルサイクラー (MJ Research社製 PTC-200)
• TempPlateセミスカート96ウェルPCRプレート (USA Scientific cat. #1402-9700)
• 384-well ソリッドブラックマイクロプレート (Corning cat. #3676)
• Microseal B PCRプレートシーリングフィルム (Bio-Rad cat. #MSB1001)
• SpectraMax i3xマルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社、商品番号i3x）
• SpectraMax M5eマルチモードマイクロプレートリーダー (Molecular Devices社製 cat. #M5e)

方法

マイクロプレートリーダー適合性試験

バリデーションキットには、希釈した蛍光色素の個別チューブが含まれていた： FAM、HEX、FAM+HEX。これらはマイクロプレートに直接分注され、熱サイクリングを必要としなかった。各フルオロフォアのチューブには、HEXとFAMシグナルの標準化を可能にする受動的参照色素であるROXも封入されており、ピペッティングによるばらつきの影響を排除しています。各フルオロフォア（HEX、FAM、HEX+FAM）5 µLを384ウェルプレートのトリプリケートウェルに分注した。プレートを透明フィルムでシーリングし、560 x gで1分間遠心した。遠心後、プレートを直ちに M5e および i3x リーダーで表 1 に示すインストゥルメンテーション設定を用いて読み取った。

KASPジェノタイピング反応の検出

第 2 の検査では、バリデーションキットに既知サンプル 36 検体（DNA サンプル 33 検体およびノー テンプレートコントロール（NTC）3 検体）を封じ込めた。各サンプル5 µLを96ウェルプレートにピペッティングし、PCRを行った。同量のジェノタイピング混合液（2x KASP Master mix + KASP Assay mix）を各ウェルに添加した。受動的参照色素ROXはKASP Master mixに含まれていた。プレートを透明フィルムでシーリングし、560 x gで1分間遠心した。熱サイクリング反応が直ちに開始された。詳細なサーマルサイクリング条件を表2に示す。反応終了後、各サンプル5μLを384ウェルプレートのウェルに移し、表1に示したインストゥルメンテーションを用いてマイクロプレートリーダーで検出した。

結果

最初のテストでは、FAM、HEX、両者の混合物を含む各蛍光体の相対蛍光単位をROXに正規化し、正規化値をSoftMax® Proソフトウェアにプロットした。図1に示すように、3つの異なるクラスタが生成された。

2番目のテストでは、増幅DNAサンプルのROX規格化蛍光をSoftMax® Proソフトウェアにプロットした（図2）。3つの明確なクラスタが検出された。FAMホモ接合体はX軸の近くに、HEXホモ接合体はY軸の近くに位置し、FAMとHEXの両方を封じ込めたヘテロ接合体サンプルは2つのホモ接合体クラスターの間にクラスタリングを形成した。ノーテンプレート対照は予想通り原点付近にクラスタを形成した。このデータは、検証キットのベンダーから提供されたジェノタイピング結果とほぼ一致した。

表1. データ取得に使用したプレートリーダーの設定。

表2. KASPジェノタイピング反応の熱サイクル設定

結論

SpectraMax M5eおよびi3xプレートリーダーは、KASPジェノタイピングアッセイでの使用が完全に検証されている。モノクロメーターベースの光学系は、反応中に存在する3つのジェノタイプすべてを表す蛍光PCR産物を検出するために必要な3つの励起／エミッション波長ペアのセットアップを容易に可能にする。どちらのインストゥルメンテーションでも一貫した結果が得られます。SoftMax® Proソフトウェアによるデータ解析とジェノタイピングにより、正規化された結果を迅速に可視化することができます。

参考文献

1. Chen, X., and Sullivan, P.F. "一塩基多型ジェノタイピング：生化学、プロトコル、コスト、スループット". The Pharmacogenomics Journal 3, (2003)： 77-96.

2. Patterson, E.L., Fleming, M.B., Kessler, K.C., Nissen, S.J., and Gaines, T.A. "A KASP genotyping method to identify nothern watermilfoil, eurasian watermilfoil and their interspecific hybrid.". Frontiers in Plant Science 8, (2017)： 752.

3. Smith, S.M., Maughan, P.J. "KASParアッセイを用いたSNPジェノタイピング". Plant Genotyping 1245, (2015): 243-256.