Application Note ELISA法を用いた大麻中の総アフラトキシンの測定

はじめに

ジョイス・イタタニ｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス
キャシー・オルセン｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス

全米の多くの州で大麻が合法化されるにつれ、州機関は栽培者、小売業者、試験所に対して独自の規制や要件を定めている。例えば、2019年1月、カリフォルニア州で大麻規制が施行され、州法に基づき、消費者の安全を確保するためにすべての大麻商品を検査しなければならなくなった。大麻に含まれる可能性のある汚染物質には、アスペルギルス属の真菌の有毒な副産物であるマイコトキシンが含まれ、摂取すると人間や動物に病気や死亡を引き起こす可能性がある。カリフォルニア州大麻取締局（BCC）は、最も一般的で危険なカビ毒であるアフラトキシンB1、B2、G1、G2、オクラトキシンAについて、大麻製品の検査を義務づけている。他の州では、アフラトキシンレベルについて独自の要件を定めている。

ストリップテストと酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）は、食品および飼料サンプルのマイコトキシン検査において一般的で比較的低コストの2つの方法である。ELISA は 96 ウェルマイクロプレートフォーマットで実施するため、ハイスループットという利点がありますが、テストストリップでは一度に 2 サンプルしか実施できません。Romer Labs 社の AgraQuant Total Aflatoxin 4/40 ELISA キットは、食品および飼料成分中のアフラトキシンの定量に使用でき、44 種類のサンプルを同時に測定できるため、多数の製品を検査する必要がある場合に大幅な時間短縮が可能です。

ここでは、AgraQuant Total Aflatoxin 4/40 ELISA キットを SpectraMax® ABS Plus マイクロプレートリーダーおよび SpectraMax® iD5 マルチモードマイクロプレートリーダーと組み合わせて使用し、最も一般的な大麻製品の 1 つである花中のアフラトキシン B1、B2、G1、G2 レベルを検査する方法を示します。サンプル前処理と ELISA の一般的なワークフローを図 1 に示す。

材料

• AgraQuant Total Aflatoxin 4/40 ELISA キット（Romer Labs 社、カタログ番号 #10002098）
• AflaStar R ラピッドクリーンアップIACカラム（Romer Labs cat.）
• アフラトキシンB1標準物質（Sigma社、カタログ番号34029）
• 大麻の花（カリフォルニアの調剤薬局から入手した品種）
• メタノール、HPLCグレード（Sigma cat.）
• 酢酸アンモニウム（Sigma cat.）
• SpectraMax ABS Plus マイクロプレートリーダー（Molecular Devices 社製 cat.）
• SpectraMax iD5® マルチモードマイクロプレートリーダー

方法

サンプルの準備

大麻サンプルをビニール袋に入れ、手で粉砕した。試料1gを秤量し、4本の50mLコニカルチューブに入れた。

その後、サンプルに0、10、20、30ppbのアフラトキシンB1標準物質を添加した。20mLの70％メタノールをサンプルに加え、チューブを3分間激しくボルテックスした。得られた抽出液をWhatmanグレード1ろ紙でろ過し、清潔な50mLコニカルチューブに入れた。

抽出され、ろ過された各サンプルから、4mLを清潔なコニカルチューブにピペッティングし、20mLの脱イオン水を加えた。全24mLをイムノアフィニティークロマトグラフィー（IAC）カラムに通した。サンプル中のアフラトキシンはカラム中の抗体に選択的に結合した。未結合物質は、20 mLの0.5 M酢酸アンモニウムでカラムを洗浄することにより取り除かれた。清浄なチューブをカラムの下に置き、サンプルを100%メタノール1mLで溶出した。

アフラトキシンELISA

トリプリケートされた各標準物質とサンプルの希釈ウェルをマイクロウェルストリップホルダーにセットした。同数の抗体固相化マイクロウェルを別のストリップホルダー（ELISAプレート）にセットした。未使用のマイクロウェルは、乾燥剤を入れたフォイルパウチに戻した。

各希釈ウェルに100 µLのコンジュゲートを添加し、続いて50 µLのアフラトキシン標準品またはスパイク検体を添加した。キットのプロトコールで指示されているように、コンジュゲートとサンプルの比率は2:1に保たれました。内容物は8チャンネルピペッターでよく混合した。各希釈液100 µLをELISAプレートの抗体固相化マイクロウェルに移し、室温で15分間インキュベートした。

インキュベーション後、ELISAプレートを脱イオン水で5回洗浄した。100μLの基質をプレートに加え、プレートを室温で5分間インキュベートした。Stop Solutionを100μL添加し、SpectraMax ABS PlusおよびSpectraMax iD5リーダーでプレート中の検体の吸光度を450nmで測定した。

結果

4, 10, 20, 40 ppbの標準物質からなるアフラトキシン標準曲線をSoftMax® Proソフトウェアにプロットした（図2および3）。各標準物質の結合率（%B/Bo）をソフトウェアで算出した。B は各標準物質の吸光度の平均値（OD）、Bo は 0 ppb 標準物質の吸光度の平均値です。抗原（Bo）を封じ込めたウェルの吸光度が最大となる。

SoftMax Proソフトウェアのフォーミュラエディターとグループテーブルを使用して、%B/BoとLogit (B/Bo)を算出した。分析がセットアップされると、SoftMax Proプロトコルとして保存され、今後のアッセイ結果の自動分析に使用できるようになりました。

スパイクされたサンプル中のアフラトキシンの回収率は、標準曲線から決定されました。10、20、および30 ppbをスパイクしたサンプルの回収率は71%から112%で、推奨基準を満たしました（表1）。

表1. スパイク回収率。アフラトキシンB1がスパイクされたサンプルにおいて、回収率はアフラトキシンELISAで許容される範囲内であった。

結論

ELISA 法は、テストストリップのような他の方法と比較して、使いやすく、感度が高く、多くの検体を扱うことができます。AgraQuant Total Aflatoxin 4/40 ELISA キットは、食品および飼料製品の安全性を保証するために必要なレベルでのアフラトキシンの定量を可能にします。ここでは、この方法が、アフラトキシン標準物質を添加した大麻の花の抽出物から回収したアフラトキシンの測定に使用できることを示しました。データは、SpectraMax ABS PlusおよびSpectraMax iD5リーダーを用いて得られた。SoftMax Proソフトウェアを用いて分析した結果、サンプルで測定されたアフラトキシンは、サンプルにスパイクされたアフラトキシンの量と一致していることが確認された。