Application Note FLIPR Tetraシステムを用いた光遺伝学的手法による
Cav 1.3チャネルアッセイの開発

はじめに

Cav1.3はL型電位依存性カルシウムチャネルであり、創薬の重要な標的である。多くの薬剤がCav1.3チャネルに対して、膜電圧（Vm）とそれに伴うチャネルの状態（開、閉、不活性化）の変化に応じて薬効が変化することを意味する明言依存的な作用を示すことが示されている1。このことは、病的に過剰活性化されたCav1.3チャネルに高い選択性をもたらすと考えられるため、異なる状態におけるチャネル遮断薬を評価するハイスループットなアッセイの開発に対する需要が高まっている。

このチャネルの現在のスクリーニング方法論は、電気生理学的手法か、膜電位を調節するためのカリウムチャレンジによる蛍光測定法のどちらかを利用しているが、どちらのアプローチにも大きな限界がある。電気生理学的方法はVmを直接制御するが、侵襲的であり、ハイスループットなアッセイにはあまり適していない。

これらの限界に対処するため、我々は、チャネルロドプシン-2（ChR2）を介したVmを制御するための光遺伝学的手法を用いた新しい解決策を報告する。青色光（470 nm）により活性化されると、ChR2はNa+の流入を仲介し、Cav1.3チャネルを最初に開状態にし、その後時間をかけて不活性化状態にする長時間の膜偏光解消を引き起こす。光の照射が終わると膜電位は再分極し、Cav1.3チャネルは静止状態に戻る。

本研究では、FLIPR Tetra®システムを用いて、状態依存性カルシウムチャネルブロッカーをスクリーニングするために、可逆的かつ精密な方法でVmを制御する光遺伝学的ツールの新規な有用性を実証した。

材料

• ChR2D156A（Chlamydomonas reinhardtii由来）、ヒトCav1.3α1＋α2δ、βサブユニット、ヒトKir2.3を共発現するHEK-293細胞株は、イタリア・ミラノのAxxam S.p.A.によって開発された。Kir2.3の発現により、Vmは最初、過分極値に設定され、細胞外に適用された高カリウム（Kir2.3に作用する）、またはオールトランス型網膜補因子存在下でのChR2の青色光刺激のいずれかに応答して偏光解消する。いずれの場合も、偏光解消されたVmはCav1.3を開口させ、細胞内へのカルシウムの侵入を可能にする。
• FLIPR Tetra System (0310-5147)、FLIPR® Calcium 6 Assay Kit (R8190)、FLIPR® Membrane Potential Assay Kit (R8042)はモレキュラーデバイス社から発売されています。

方法

オプトジェネティクスの強力な応用として、光感受性アクチュエータを用いたVm制御がある。本研究では、C. reinhardtii由来の光感受性ChR2タンパク質を用いて、状態依存性Cav1.3遮断薬のハイスループットなアッセイの基礎としてVmを制御した。具体的には、ChR2D156A 変異体は FLIPR Tetra システムの LED から発せられる青色光（470 nm）により活性化され、Na+ に対する透過性により強固で長時間の膜偏光解消が誘導され、開状態の時定数は約 6.9 分に延長される3 。偏光解消の結果、Cav1.3チャネルはまず開口し、Ca2+イオンの細胞内への侵入を可能にし（図1）、時間の経過とともに非伝導性の不活性化状態へと移行する（図2）。細胞内カルシウムのカイネティクスの変化は、FLIPRカルシウム6アッセイキットを用いてFLIPR Tetraインストゥルメンテーションでモニターされます。

ChR2によるVmの制御

ChR2によるVmの制御を検証する第一段階として、FLIPR膜電位色素（Ex 530 nm/Em 565 nm）を用いて、Vmの変化による蛍光シグナルの変化を測定する。ChR2、Kir2.3、Cav1.3をトランスフェクトしたHEK-293細胞を、オールトランス型レチナール補因子の存在下、標準プロトコールに従ってFLIPR膜電位色素とインキュベートする。FLIPR Tetraシステムを用い、青色LEDの光パルスでChR2チャネルを刺激することで膜偏光解消を誘導する。第二のプロトコールは、膜電位色素を励起し、蛍光発光の経時変化を測定するものである。膜の偏光解消は蛍光シグナルの増加によって反映される。最初の青色光刺激の終了後、ChR2チャネルは閉状態に移行し、Vmの再分極が可能になり、その結果、蛍光シグナルは経時的に減少する。

Cavの制御 1.3 by ChR2

ChR2、Kir2.3、Cav1.3をトランスフェクトしたHEK-293細胞に、オールトランス型レチナール補因子の存在下、まずFLIPR Calcium 6色素を負荷する。FLIPR Tetraシステムを用い、細胞に青色光をパルス照射してChR2を刺激し、蛍光の変化からCav1.3を介して細胞内にカルシウムが侵入していることがわかる。その後の実験では、Cav1.3の不活性化からの回復を調べるために、最初のパルスからさまざまな時間間隔をおいて2回目の光パルスを照射するデュアルパルスプロトコルを採用した。

カリウムチャレンジによるCav1.3の制御

参考として、カリウムチャレンジによるCav1.3チャネルの活性を分析する標準的な方法を、同じ細胞株を用いて行った。高カリウムが細胞外に印加されると、膜電位は偏光解消し、Cav1.3チャネルの開口とカルシウムイオンの細胞内への侵入を可能にする（図1）。時間の経過とともに、Cav1.3は不活性な非伝導状態になる。細胞内カルシウムの増加を測定するために、FLIPRカルシウム6色素が用いられる。この方法では、高濃度のK+を細胞に作用させる必要があるが、これは非生理的であり、多くの "オフターゲット "効果をもたらす可能性がある。さらに、カリウムイオンはウェルから除去できないため、このような適用は不可逆的である。

薬理学

薬理学的アッセイにおけるオプトジェネティクスの有用性を検証するために、Cav1.3チャネルを遮断する状態依存性阻害剤イズラジピンを用いて一連の実験を行い、閉鎖状態と不活性化状態の両方におけるIC50の結果を解析した。オプトジェネティクス、Kir2.3に基づく高カリウム添加、パッチクランプなど、Cav1.3チャネルを活性化する3つの方法を比較し、両方の状態におけるイズラジピンのIC50値を決定した。

結果

ChR2によるVmの制御

光活性化ChR2による膜電位制御は、ChR2をトランスフェクトしたHEK-293細胞をFLIPR膜電位色素とインキュベートすることで検証した。FLIPR TetraシステムLEDから青色光をパルス照射すると、膜が偏光解消し、FLIPR Membrane Potential色素からのシグナルが3倍増加した（図3a）。膜電位シグナルを経時的に記録すると、最初の青色光刺激から約30分後に膜が再分極し、蛍光シグナルはSB比に戻った。このデータは、青色光刺激によりChR2が開口したとき、まずVmが偏光解消し、ChR2チャネルが閉じるにつれてVmが再分極したことを示唆している（図3b）。

ChR2はCav1.3応答を誘導した

トランスフェクトしたHEK-293細胞をFLIPRカルシウム6色素とともにインキュベートした。青色LEDからのパルス光により、カルシウムイオンが細胞内に入ると蛍光シグナルが増加した（図4a）。続いて、Cav1.3チャネルの不活性化からの回復の時間依存性を同定するために、細胞を二重パルスプロトコルにかけた実験（図4b）を行った。10分間のインターバルの後、カルシウムフラックスシグナルの半分が記録された。45分のインターバルの後では、ほぼ100％のシグナルが記録された。このデータから、最初の光パルスから10分後、チャネルの半分はまだ不活性化状態にあり、その結果、カルシウムシグナルは最大値の50％になったことが示唆される。

カリウム・チャレンジ

Cav1.3 チャネルの状態を K+でコントロールするため、トランスフェクトした HEK-293 細胞株を FLIPR Calcium 6 dye ローディング対照バッファー中で、4 mM から 75 mM までカリウム濃度を増加させながら 37℃で 1 時間インキュベートした。その後、FLIPR Tetraシステムでカルシウムシグナルを検出する間、75 mMの高濃度のK+を添加した。代表的なカルシウムシグナル応答を図5aに示す。K+負荷濃度とFLIPRカルシウム6色素からのシグナルをプロットしたK+依存不活性化曲線から、最大Ca2+シグナルの50%を誘導するK+濃度は22 mM K+であることがわかった（図5b）。

薬理学

Cav1.3に対する状態依存的な作用が知られていることから、抗高血圧薬でありパーキンソン病の進行抑制にも有用と考えられるイズラジピンを本研究に選択した。ChR2を用いた光遺伝学的プロトコルを用いて、Cav1.3を発現するHEK-293細胞を、異なる濃度のイズラジピン存在下、37℃で1時間、FLIPRカルシウム6色素とともにインキュベートした。FLIPR Tetraシステムで青色光パルスを照射し、閉 鎖状態でのカルシウム流入に伴う蛍光シグナルの増加を 測定した。10分後、2回目の青色光パルスを照射し、不活性化状態でのカルシウム流入に伴う蛍光の変化を記録した。元のカルシウムシグナルの半分しか見られなかった。結果は図6aのグラフに％Cav1.3応答として示されている。高K+プロトコールに従った実験から得られたイスラジピンIC50曲線を図6bに示す。以前のカリウム実験に基づき、4 mM K+または 22 mM K+をFLIPRカルシウム6色素負荷バッファーに添加し、それぞれ閉鎖状態および不活性化状態を誘導した。75mMのK+はFLIPR Tetraシステムでカルシウムシグナルを検出する際に添加した。図6cには、パッチクランププロトコルを用いた閉 鎖状態および不活性化状態におけるCav1.3のイズラジピンブロッ クのIC50曲線が示されている。

概要

過去のパッチクランプの結果を含め、閉じた状態と不活性化した状態の両方におけるイズラジピンのIC50値の比較を表1に示す。Cav1.3の不活性化状態でのIC50値は、閉じた状態での値に比べ、どの方法でも約10倍の左シフトが保たれている。イオンチャネルに対する化合物の影響は、閉じた状態と不活性化した状態では臨床的な意味合いが異なる可能性があるため、このことは重要である。光遺伝学的プロトコールでは、IC50値は "ゴールドスタンダード "電気生理学的手法で得られたIC50値に近い。オプトジェネティクスで得られた「レシオブロック」値は、電気生理学的手法で得られた値と非常に類似しており、高い生物学的関連性を示唆している。電気生理学的アッセイとは異なり、オプトジェネティクスアッセイのセルは実験エンドツーエンドで無傷である。さらに、光駆動のオプトジェネティクスのプロトコルは可逆的であり、これは柔軟なアッセイプロトコルにとって非常に望ましい特徴である。

表1. 閉状態および不活性化状態におけるイズラジピンIC50の結果のまとめ。光遺伝学的プロトコルの結果が電気生理学的および文献的結果に最も近い。

謝辞

実験および図表はAxxam S.p.A.（イタリア、ミラノ）より提供された。

参考文献

1. Koschak、A.ら、J. Biol. Chem. 2001, 276:22100-22106
2. Prigge, M., Rossler, A., Heggeman, P., Channels. 2010, 5月/6月, 4:3, 241-247
3. Berndt, A., Yizhar, O., Gunaydin, L., Hegemann, P., Deisseroth, K., Nat Neurosci. 2009, Feb;12(2):229-234.
4. Catterall WA, Perez-Reyes E, Snutch TP, Striessnig J. Pharmacol Rev. 2005 Dec;57(4):411-25.