Application Note SpectraDrop™Micro-Volumeマイクロプレートを
用いたタンパク質の直接定量
- わずか2 µLの少量タンパク質定量
- 一度に24または64サンプルのハイスループット測定
- リニアダイナミックレンジは35億倍以上
- 希釈の必要がなく、高濃度サンプルの正確な定量が可能
PDF版（英語）
はじめに
UV吸光度を用いたタンパク質の定量は、タンパク質中のトリプトファンとチロシン残基による近UV波長の光の吸光度に依存する、迅速で非破壊的な方法である。UV分光光度計やUV検出機能付きマイクロプレートリーダーを用いて行うのが一般的である。この方法は、追加の試薬や標準物質の使用を必要としないので便利である。
従来のキュベット分光光度計では、通常、大量の溶液が必要であり、定量範囲はタンパク質の約0.05mg/mLから2mg/mLに制限される。マイクロプレートフォーマットで正確に測定できるタンパク質濃度の範囲は、使用するマイクロプレートリーダーやプレートフォーマットにもよるが、もう少し広い。キュベットやマイクロプレートベースの定量法では、およそ2～5 mg/mLのタンパク質が上限となるため、高濃度のタンパク質サンプルでは限界希釈法が必要となり、望ましくない溶解度の影響やピペッティングエラーが生じる可能性があります。
SpectraDrop™Micro-Volumeマイクロプレートは、2 µLという少量のサンプルをハイスループットで測定できるソリューションです。SBS設置面積の特別設計アダプター、24または64サンプル容量のテフロンコートボトムスライド、蒸発低減スペーサー付きトップスライドが組み込まれています（図1）。SpectraDrop プレートは、パス長 0.5 mm の 2-µL サンプルまたはパス長 1 mm の 4-µL サンプルのいずれかを測定するように設定できます。特異性のあるパス長は、0.5 mmまたは1 mmのスペーサーを備えたカバースライドを使用して実現します。
このアプリケーションノートでは、SpectraDropマイクロプレートを使用して測定できるウシ血清アルブミン（BSA）濃度の直線範囲は、約0.012 mg/mLから100 mg/mLまでであり、サンプル希釈の必要がないことを示しています。
図1. SpectraDrop™Micro-Volumeマイクロプレートのアセンブリです。
材料
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）
- PBS中の30% BSA（300 mg/mL）
- 1.5-mL LoBind Protein微量遠心チューブ（エッペンドルフ社製 cat. #022431081）
- SpectraDrop™Micro-Volumeマイクロプレート
- 石英分光光度計セル (Starna Cells cat. #21-Q-10 #21-Q-10)
- SpectraMax® i3/i3x マルチモードマイクロプレートリーダー
- SpectraMax Plus 384吸光マイクロプレートリーダー
方法
BSAの1:2希釈系列を100 mg/mLからPBSで調製し、LoBind微量遠心チューブに入れた。2µLまたは4µLのサンプルを、図2のプレートマップに従って、64ウェルSpectraDropスライドに4回に分けてプレーティングした。H21-K22の位置にはPBSのみのプレートブランクを封じ込めた。プレートは、SoftMax® Proソフトウェアで事前に設定したSpectraDropプロトコルを使用して、SpectraMax Plus384吸光マイクロプレートリーダーおよびSpectraMax i3xマルチモードマイクロプレートリーダーで読み取りました。ブランク減算と標準カーブフィット処理はソフトウェアが自動的に行った。比較のため、BSA希釈液もサンプル量2mLの石英キュベットで読み取った。
図2. 64ウェルSpectraDropセットアップのプレーティングマップ。
測定結果
SpectraDropプレートでの低容量タンパク質測定では、2µLサンプルを使用した場合、リニアダイナミックレンジは約0.024 mg/mLから100 mg/mLに及びました。サンプル量を4 µLに増やすと、測定範囲は約0.012 mg/mLから50 mg/mLに減少しました。いずれのサンプル量でも、測定可能な濃度範囲は3.5十年以上でした（図3）。
図3. SpectraDrop™Micro-Volumeマイクロプレートで測定したBSAの直線性とダイナミックレンジ。4µL（青プロット）および2µL（赤プロット）サンプルのデータを示す。両標準曲線のr2値は> 0.99です。
キュベットを用いた測定と比較すると、低容量フォーマットでは、測定可能なタンパク質濃度範囲が16倍に拡大した（図4）。これはサンプルパスの長さが短くなったためである。キュベットのサンプルパスの長さは1cmに固定されており、サンプル濃度がインストゥルメンテーションで測定可能な直線範囲を超えると、正確に定量するためにはサンプルを希釈する必要がある。SpectraMax Plus384リーダーで観測されたPBS中のBSAの定量限界は約6 mg/mLでした。SpectraDropプレートでサンプルパスの長さを0.5 mmに縮めると、100 mg/mLという高濃度の2-µL BSAサンプルの測定が可能になった。
図4. SpectraDrop™Micro-Volumeマイクロプレートまたは光路長1cmの石英キュベットでのBSA測定の比較。データは、2µL SpectraDrop プレート（青色プレーティング）サンプルとキュベット（赤色プレーティング）サンプルについて示しています。比較を容易にするため、SpectraDrop の OD 値は、サンプルの光路長が 1 cm の場合の値に調整されています。両方の標準曲線のr2値は> 0.99です。SpectraDrop プレートでは、ダイナミックレンジが 100 mg/mL まで拡張されます。
結論
SpectraDrop™Micro-Volumeマイクロプレートには、2つの利点があります。第一に、2 µL という少量のサンプルの定量が可能である。第二に、サンプルパスの長さが短くなるため、キュベットやマイクロプレートでは対応できないような高濃度のサンプルの定量が可能になります。SpectraDropプレートは、12 µg/mLから100 mg/mLまでのBSAサンプルの定量に使用でき、そのダイナミックレンジは30.5十年を超えます。
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