Application Note ラベルフリーイメージングアプリケーションにおける
CloneSelect Imagerの多様な有用性

はじめに

サルマド・アルバッサム博士｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス社

対物レンズ、カメラ、ソフトウェアの進歩により、顕微鏡は一般的でルーチンな作業を自動化できるようになり、ライフサイエンスにおける発見や製造グループに応用されている。しかし、自動化された顕微鏡で撮影をセットアップすることは、時間、労力、専門的なトレーニングに多大な投資を必要とする困難な作業である。取得時間のばらつきも、研究・開発グループの生産性やスループットのニーズに寄与する問題かもしれない。また、画像露光と焦点面を最適化し、下流の解析のために高品質なデータを確実に取得するという課題もある。

標識不要マイクロプレートフォーマットでの生物製剤の定量化にも課題がないわけではない。ひとつには、標識不要の画像はSB比のコントラストが低く、解析が困難である。もう一つの一般的な問題は、多数のタイル画像を必要とする広い視野の生物学の解析に関係しています。最後に、不連続に取得されたさまざまなタイムポイントのウェル画像とメタデータをリンクさせることは困難な場合があります。

ユニークなバキュームベース設計により、様々なPlateタイプの画像に確実にフォーカスを合わせ、1枚のPlateを約90秒で高速撮影します。また、ホールウェル解析やマルチタイムポイント解析を伴う生物製剤の研究にも適しています。ここでは、一般的なラベルフリーイメージングの様々なアプリケーションと、多数のマイクロプレートフォーマットにおける本システムの有用性について説明する。

結果

6ウェルプレートでのコロニーカウント

標識不要の一般的なアプリケーションは、マイクロプレートの全ウエルで対物レンズ（コロニーなど）をカウントすることである。典型的な例としては、半固形培地中でコロニーに成長する単一細胞の能力に基づくin vitro細胞生存アッセイであるクローン形成アッセイ（コロニー形成アッセイとしても知られている）があります。もう一つの一般的な用途は、スクリーニングのための半固形培地におけるコロニー増殖速度の特性評価である。下流のスクリーニング作業では、不均一性集団から高分泌または高結合の標的を探すことがある。このようなアプリケーションでは、スループットとウェル面積のバランスがとれている6ウェルプレートが一般的に使用されるウェルフォーマットです。これらのアプリケーションでは、プレートのウェル全体を迅速に画像化し、得られたデータに対して対物レンズを実行できることが最も重要である。このような解析には、コロニー数やサイズのような解析パラメーターを定量化し、さらなる解析のためにローデータとメタデータをエクスポートできる機能が含まれます。

CloneSelect Imagerは、コロニーの可視化と特性解析のために6ウェルプレートのイメージングを可能にします。一例として、SJK-285マウスハイブリドーマ細胞を封じ込めた6ウェルプレートを7日目にスキャンしました（図1）。Plate Thumbnailsタブに各ウェルの内容を示すプレー トビューが表示される（図1B）。このビューでは、コロニーの存在を検出するアルゴリズムは緑色で表示され、背景は黒く表示されることに注意してください。各サムネイルをクリックすると、ウェル全体が表示されます。この画像には、10×10タイルの4倍画像のマトリックスが封じ込められ、互いにアライメントされ、ソフトウェアによって1つのウェルとして評価されます（図1C）。

迅速な画像取得により、プレートは約90秒でスキャンでき、On-the-fly解析により効率的かつ対物レンズで定量できる。Loci Countタブに移動すると、ウェル内の対物レンズをサイズ（面積）とコンパクトさ（円形度としても知られる、図1D）に基づいてゲートすることができます。ユーザーは、すべてのウェルのコロニー座位を適切にセグメンテーションするレベルに到達するために、これら2つのパラメーターのゲーティングしきい値を操作することができる（図1E）。これは、ウェル間をトグルして、ウェル間のセグメンテーションの有効性をチェックすることで確認できる。最後に、Loci Countタブ内のプレー トビューに戻ると、コロニー数を視覚的に確認することができます。データエクスポートボタンにより、各プレートの関連データをエクスポートできます。エクスポートはCSV、XML、Excelなど複数のフォーマットに対応しています。表1に、各ウェルの遺伝子座カウントと平均遺伝子座面積を含む典型的なエクスポート例を示します。異なる時点で複数回スキャンすることで、異なる日の遺伝子座の大きさのデータを得ることができます。このデータを集計することで、異なるタイムポイントにおける平均コロニーサイズを読み取ることができる。

表1. コロニー（遺伝子座）数とウェルあたりの平均遺伝子座面積を示す、図1のプレートからエクスポートしたデータ。

96ウェルおよび384ウェルプレートでのモノクローナリティ評価

コロニー計数に加えて、標識不要の一般的なアプリケーションは、モノクローナリティ評価とクローンアウトグロースの特性評価です。このアプリケーションでは、所定の細胞集団の限界希釈法を設定し、所定のプレート内のウェルのサブセットのみに単一細胞を播種する。ハイスループットの必要性と、1536ウェルプレートを使用 することによる単一細胞の播種効率の限界とのバランスがとれてい るため、96ウェルプレートや384ウェルプレートがこの用途によく使 われます。限界希釈法では、単一細胞がポアソン分布に基づいてクラスタリングするため、後で単一細胞由来のクローンを単離することができます。

CloneSelect Imaagerは、モノクローナル関連アプリケーションの迅速なデータ作成を可能にします。96ウェルまたは384ウェルプレートのプレートスキャンは、3.7μm/ピクセルの標準解像度で、簡単かつ迅速に取得できます。取得後、Plate Thumbnailsタブにアクセスすると、プレートレベルからナビゲートできます（図2B、2D）。このインターフェースから、ユーザーは単一のコロニーを封じ込めたウェルをクリックすることができる（図2C、2E）。指定したコロニーが単一のセルに由来するかどうかを判定したい場合は、Report Generatorタブにアクセスすることで可能である。このタブでは、異なる日数にわたって取得された様々なスキャンがリンクされている。これにより、単一コロニーのタイムポイントからウェルを表示し、単一細胞が播種された最初の日に戻ることができます。セル領域（黄色のボックス、図2C、E）を指定し、その後のタイムポイントごとに調整することで、指定したウェルのモノクローナリティレポートを自動作成することができます。図 2F は、一般的にエクスポートに含まれる多くの異なるタイムポイントからのセル領域の例を示しています。

96ウェルハーフエリアプレートでのコンフルエンシー測定

標識不要のもう一つの重要なアプリケーションは、ウェル のコンフルエンス評価である。コンフルエンスは、実験終了時に静的タイムポイントスキャンを取得するエンドポイントプロセスである場合があります。96ウェルプレートフォーマットが一般的に用いられるが、96ウェルハーフエリアプレートをプレーティングする研究者も増えている。実験例では、96ウェルハーフエリアプレートを用いて、細胞集団の連続希釈を設定し、最上段の10,000個/ウェルから始めて、B～H列で2倍ずつ希釈しています（図3A）。図3Bは、Plate Thumbnailsタブビューを示しています。このソフトウェアでは、細胞の種類や形態に応じて、3種類の閾値設定アルゴリズ ムから選択することができます。あらかじめ設定された適切な閾値アルゴリズムを適用することで、その場でコン フルエンス％を計算することができる。Confluenceタブに移動すると、プレーティングレベルのコンフルエ ンシーデータを円グラフ形式で可視化することができ、完全な円グラフは指 定したウェルにおける100％のコンフルエンスを表す（図3C）。コンフルエンスデータから、ウェルあたりの細胞数を推定することも可 能です（図3D）。セル数の推定には、特定の細胞タイプについて既知の播種密度に基 づく標準曲線を確立する必要がある。

あるいは、コンフルエンスはカイネティックプロセスとして適用されるのが一般的で、複数のタイムポイントスキャンを取得し、データをプロットして成長曲線を作成する。この用途では、コンフルエンスは細胞集団の増殖特性を 特徴づけるのに重要であり、細胞株開発において重要な 役割を果たす。例えば、（限界希釈法またはシングルセルプリンティングのいずれかによる）シングルセルウェルからの増殖の特徴を調べ、増殖の低いクローンを除外することや、コロニーピッキング後の細胞集団の増殖速度を特徴付けることなどが挙げられます。Growth Rateタブに移動すると、様々な取得タイムポイントをリンクできます（図3E）。研究者は、特定のウェルの増殖率を、プレート内の他のウェルと比較して比較することができます。様々なタイムポイントのコンフルエンスとセル数のデータは、共通フォーマットにエクスポートして、さらに詳しく分析することができます。

結論

ラベルフリーイメージングは、マイクロプレート内の生物学のサンプルを評価する最も直接的で非侵襲的な方法です。一部のアッセイでは、ラベルフリーイメージングによってマイクロプレート内の細胞増殖を非侵襲的に観察することができ、研究者は実験を論理的なエンドポイントまで実行することができます。これに対し、比色分析や蛍光イメージャーによるアッセイでは、サンプルを固定し、マーカーを染色する必要があるため、実質的に観察時点で実験が終了することになる。ラベルフリーイメージングは、細胞株開発プログラムのような生物製剤製造環境において、他のアプリケーションの中でも高い応用性を発揮します。

CloneSelect Imagerは、多くの有効なプレートフォーマットにおいて、一定の焦点高で迅速にラベルフリーイメージングを行うのに理想的です。6ウェルプレート、96ウェル標準プレートおよびハーフエリアプレート、384ウェルプレートなど、多様なプレートフォーマットを用いて、さまざまなアプリケーションのデモンストレーションを行いました。また、オムニトレイ、丸底プレート、12ウェル、24ウェル、48ウェルプレートなど、その他のプレートフォーマットの画像化も可能です。このイメージングシステムは、プレート全体を約90秒でイメージングすることができ、On-the-fly画像解析を使用して画像ベースデータから対物レンズの洞察を得ることができます。セルと物体のセグメンテーションのための所定のアルゴリズムにより、一連の生物学的アプリケーションのための正確で精密な測定が可能になります。標識不要データの対物レンズ解析により、将来の実験に向けた一貫性のある情報に基づいた決定が可能になります。