Application Note SpectraMaxマイクロプレートリーダーを
用いたDNAおよびRNAの吸光度測定

はじめに

Molecular Devices社が初めてUV対応のマイクロプレートリーダーを発売した時、マイクロプレートでの紫外線（UV）測定が可能になった。それ以来、DNA、RNA、タンパク質のマイクロプレート測定は非常にポピュラーになった。しかしながら、マイクロプレートアッセイでは、特にUV領域で正確な吸光度結果を得るために、マイクロプレート材料の光学特性を認識し、従来のキュベットよりも技術に注意を払う必要がある。このような細部への注意が欠けていることが、アッセイをマイクロプレートに適合させることを困難にする最も頻繁な原因である。

マイクロプレートによる吸光度測定は光路長のばらつきがあり、気液界面での表面効果による干渉を受けやすい。最新のマイクロプレートリーダーは、旧式のワイドビームプレートリーダーよりも光ビームが小さいため、ホコリによるスプリアスの影響を受けやすい。読み取り時に光ビームの中に粒子があると、最大0.3 ODのアーティファクト吸光度スパイクを引き起こす可能性がある。したがって、サンプル溶液に粒子がないことが特に重要です。マイクロプレートで正確で再現性のある吸光度結果を得るためには、上記のすべての要因に留意する必要があります。ここでは、SpectraMax®マイクロプレートリーダーでDNA/RNA吸光度測定を最適化するためのガイドラインを示します。

材料と方法

• SpectraMaxマイクロプレートリーダー（UV吸光度検出付き）（Molecular Devices社製
• UV透過マイクロプレート
  ⚪︎使い捨て： コーニング社製 #3635またはGreiner cat. #655801
  ⚪︎石英: Hellma社製 #730.009-QG

最高品質のDNA吸光度値を得るための推奨事項

1. 清潔なマイクロプレートと粒子のない溶液を使用する。バッファーをフィルタリングして（例えばポアサイズ < 5 µm）微粒子を除去し、最良の結果を得るために、使い捨てマイクロプレートを再使用しない。すぐに読み取らない場合は、マイクロプレートに蓋をしてください。
2. バッファーブランクの吸光度値を記録する（少なくともトリプリケートでブランクを含める）。ブランク値が期待される範囲に入らない場合は、マイクロプレートの汚れ、ウェル内の微粒子、またはマイクロプレートの欠陥が原因である可能性が最も高い。使い捨てUVマイクロプレートのプレーティングバックグラウンドOD値は、ロット間でわずかに異なります。新しいロットのきれいな水を満たしたプレートを読み取ることで、予想される平均OD値を決定する必要があります。表 1 に、UV 透明マイクロプレートの OD260 と OD280 の概算値と標準偏差（SD）を示します。コーニング UV プレートとグライナー UV プレートのバックグラウンド OD 値は、石英マイクロプレートとほぼ同等です。
3. 低吸収サンプルの場合は、最大光路長（したがって最大吸光度）を得るために最大容量（250～300 µL）を使用する。可能であればデュプリケートまたはトリプリケートも使用する。左右対称のメニスカス形成を促すため、プレートを短時間オートミックスする。
4. 少量のサンプル（1～20 µL）と希釈液を使用する場合は、少量のサンプルを最初にウェルにピペッ トし、次に少量のサンプルをウェルにピペッ トします。SpectraMaxインストゥルメンテーションで10～20秒間自動混合し、混合を完了します。少量の試料を最後に添加した場合、混合が不完全なため、結果に大きなばらつきが生じることがあります。
5. イオン強度を上げると吸光度が低下することに注意してください1,2。DNAを水ではなくTEバッファー生理食塩水に溶解すると、吸光度が約23%低下します（図2）。最高の感度を得るためには、DNAサンプルは脱イオン水に溶かす必要があります。

表1. 260 nmおよび280 nmにおけるマイクロプレートの光学濃度。値は清浄なプレート5枚の平均値で、各プレートには200 µLの水が満たされている。*コーニングUVプレートでは、波長260 nmの平均値はロット番号により0.046～0.057の範囲であった。

PathCheckを使用して吸光度値を1cmの光路長に正規化する

SpectraMaxマイクロプレートリーダーにはPathCheckテクノロジーが搭載されており、マイクロプレートの各ウェルの光路長を測定し、吸光度値を1cmの光路長に正規化することで、1cmのキュベットで得られた値と同じにします。

1cmあたりのASample = ASample / pathlengthSample (cm)

光路長を正規化する前に、マイクロプレート自体の OD を考慮する必要があります。マイクロプレート内のサンプルの生のODは以下の通りです：

ODTotal = ASample + ABlank + ODmicroplate

ASampleとABlankはどちらも経路長に依存します。ODmicroplateはマイクロプレート材料のODと表面からの反射によるもので、経路長に依存しません。したがって、上記の最初の式で経路長正規化吸光度値を計算する前に、まずこれを差し引く必要があります。SoftMax® Proには、ODmicroplateを減算するための2つのオプションがあります。サンプル量が変動する場合は、オプション1を推奨します。すべてのウェル容量が同じ場合は、ODmicroplateを通常の試薬ブランクに含めることができます（オプション2）。

PathCheckの計算でマイクロプレートのODを除去するオプション

オプション1：プレーティングバックグラウンドODを使用する

(バックグラウンドが低く均一なマイクロプレートに推奨)。

新しいロットの使い捨て UV マイクロプレートごとに、PathCheck で使用する各波長における OD マイクロプレート（「プレートバックグラウンド OD」）を測定します。清浄なプレートにウェルあたり100～200μLの水を入れ（水は190～900nmの間で光をほとんど吸収しないため、量は重要ではありません）、プレートを読み取ります。空気は水と屈折率が異なるため、OD値が異なるので、乾いたプレートは使用しないでください。ある波長における平均ODは、その波長におけるプレートバックグラウンドODです。260 nmと280 nmにおけるODmicroplateの値は、表1に示す値と類似しているはずです。260nmでSDが0.003より大きい場合は、マイクロプレートが汚れているか、欠陥がある可能性があります。

Plate Background ODを決定したら、SoftMax ProのData Reductionダイアログボックスに入力します。通常通り、Template Editorでサンプル、標準品、ブランクの位置を指定し、それに従ってマイクロプレートに注入します。プレートを読み取ると、SoftMax Proは自動的に以下の処理を行います：

1. 生のウェル吸光度値からPlate Background ODを差し引きます。
2. すべてのサンプル、標準品、ブランクにPathCheckを適用します（Reduction*で選択を解除していない限り）。
3. 試薬ブランクを差し引きます。

*PathCheckの選択を解除すると、プレートのバックグラウンド減算も解除されます。

オプション 2: ODマイクロプレートをプレートブランクの一部に含める

すべてのウェルの容量（およびパスの長さ）が同じで、すべてのサンプルが同じ溶液でブランクされている場合に、このオプションを使用します。

設計上、SoftMax Proは経路長の正規化後にプレートブランク（試薬ブランク）を差し引きます。ODmicroplateは、すべてのサンプル量とブランク量が同一である場合（およびその場合のみ）に、プレートブランクの構成要素として差し引くことができます。

マイクロプレート内の3つ以上のウェルを選択し、ブランキング溶液（通常は水またはバッファー）を封入します。SoftMax ProのTemplate Editorで、これらのウェルを "Plate Blank "**として割り当てます。残りのウェルをサンプルおよび標準液として指定し、それに従ってプレートを準備します。プレートを読み取ると、SoftMax Proは自動的に以下の処理を行います：

1. すべてのサンプルとブランクにPathCheckを適用します（選択を解除した場合を除く）。
2. マイクロプレートの各ウェルからブランクの平均値を差し引きます。すべてのサンプルとブランクのパス長が同一であることを前提に、ODmicroplateにパス長正規化を適用する際の潜在的なエラーはキャンセルされます。

**SoftMax Proは、マイクロプレートの各ウェルからプレー トブランクウェルの平均吸光度値を差し引きます。

SpectraMaxリーダーでのDNA測定例

子牛胸腺 DNA のアリコート（水中 0.1-2.0 µg/mL）を、PathCheck を適用した Corning UV マイクロプレートで 260 nm で読み取った（図 1）。計算上の検出限界（ゼロ以上のブランク値の3正のSDより高い吸光度値を産生する量）は約25ng/ウェルであった。非常に保守的な基準（ゼロを超える試薬ブランク値の10正のSDsより高い吸光度値を生じる量）を用いて計算した定量限界は、約75ng/ウェルでした。300μLを封じ込めたウェルでは、この限界値は250ng/mLとなる。より低い限界値は、より控えめな基準で達成できますが、技術に厳密な注意を払う必要があります。上記の結果は、最適条件下であらかじめ希釈した溶液を用いて得られたものです。その代わりに、各ウェルに少量の犠牲DNAサンプルと希釈液を入れるプロトコールでは、定量限界は多少高くなる。

マイクロプレートの結果は、分光光度計のA260測定によるDNAの検出限界とよく一致している3,4。これは、入手可能なUV透過マイクロプレートが高品質であること、マイクロプレートウェル全体の光路長が約1cmであることを考慮すると、予想外の結果ではない。DNA濃度が低い試料を封じ込めた場合、UV吸光度では測定できず、蛍光色素との反応など、別の手法でしか測定できない。

吸光度を用いたDNA/RNAの推定

DNA/RNA濃度は、一般的にA260値を1cm吸光度の値で割る（またはその逆数を掛ける）ことで推定されます。PathCheckを使用すると、SpectraMaxリーダーは自動的にサンプルの吸光度値を1cmの光路長に正規化し、濃度を計算することができます。260nmにおける二本鎖DNAの1/吸光度の値は、一般に1cmの光路長に対して◎～50μg/mLと仮定されている3,4。しかし、この値が正しいのは、溶液の塩濃度が比較的高い場合に限られるようである（図2）。DNAはTEバッファー中では水よりも吸光度が15%低く、TE＋生理食塩水（TES）中では23%低い。1/吸光度の計算値は、水、TE、TES中のDNAについて、それぞれ38、45、50μg/mLであった（図2の挿入図）。

SoftMax Proを使用したDNA濃度の計算

DNA/RNAアッセイプロトコルでは、作業可能なサンプル量を得るために希釈剤を加えた少量（2～10 µL）サンプルのA260測定を行うことがよくあります。例えば、シークエンシングやその他のアッセイに先立ち、血液や組織サンプルからDNAを抽出する場合です。アッセイに進む前に、抽出液の少量の犠牲アリコートのDNA濃度を測定し、その結果を使用して、所望のDNA量をアッセイに移すために必要なアリコートのサイズを計算します。SoftMax Proは、SpectraMaxリーダーからのA260値を自動的に正規化し、濃度を決定し、目的のアリコートサイズを計算することができます。SoftMax Proは、0.5 µL単位で設定可能なリキッドハンドリングシステムに対応するため、0.5 µL単位で四捨五入することもできます。図3は、犠牲となる分注量が5 µLで、アッセイの目標量が0.4 µgの場合の例です。各サンプルについて公称分注量が計算され、その量も0.5 µL単位で四捨五入されました。これらの計算結果は、外部のデータ処理システムで使用するために簡単にエクスポートできます。

*400ngを移動するのに必要なアリクオットサイズ
**アリコート量は0.5 µL未満を四捨五入。

図3. DNA抽出物。SoftMax Proで作成されたレポートの例。DNA抽出物の結果と、アッセイへの移し替えなど、指定した量のDNAを封じ込めるために必要な分注量の計算結果が記載されている。

結論

技術に注意すれば、正確で再現性のあるDNA/RNA測定をマイクロプレートで簡単に行うことができます。定量下限値は、従来のUV-VIS分光光度計で得られた値に匹敵する。測定結果は、PathCheckを使用して1cmの光路長に自動的に正規化することができ、標準的な1cmの光路長のキュベットで得られた値と同等の値が得られます。SoftMax Proは、特異性のある量のDNA/RNAを封じ込めるのに必要な分注量を計算し、結果をカスタマイズしたウェルフォーマットで報告することができる。SoftMax Proには、吸光度ベースの核酸定量法用にあらかじめ設定されたプロトコルがあり、データの作成と解析が容易です。

参考文献

1. Beaven, G.H., E.R. Holiday and E.A. Johnson. 1955. 核酸とその成分の光学的特性、493-553頁。核酸、第1巻。Academic Press, New York. (E. Chargaff and J.N. Davidson, Eds.）
2. Wilfinger, W.W., K. Mackey and P. Chomczynski. 1997. 核酸純度の分光光度法による評価におけるpHとイオン強度の影響。BioTechniques 22: 474-479.
3. Sambrook, J., E. Fritsch and T. Maniatis. 1989. 分子クローニング： A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
4. Gallagher, S.R. 1994. 吸収および蛍光分光法によるDNAおよびRNAの定量。Current Protocols In Molecular Biolgy, Vol.3. John Wiley & Sons, pp.A3.D.1-A3.D3.

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