Application Note EarlyTox 心毒性キットは、生物学的な心毒性データを
創薬プロセスの早い段階で提供します

はじめに

創薬の初期段階において心毒性を評価することは、毒性を持つ可能性のある化合物を開発から除外するために重要である。ハイスループット・スクリーニングに適した生物学的関連性の高い予測性の高いin vitroアッセイは、心臓の安全性評価で失敗した化合物に関連する高いコストを削減し、効率を改善するために重要である。幹細胞由来の心筋細胞は、GPCRやイオンチャネルを発現する一方で、本来の心筋細胞と同様の自発的な力学的・電気的活性を示すため、特に魅力的な細胞モデルである。

EarlyTox™ 心毒性キットは、心筋細胞の拍動に伴う細胞質カルシウムの変化を測定するために最適化された、新規のカルシウム感受性色素と特許取得済みマスキング技術を含んでいます。拍動パターンの特性評価には、短い積分時間が必要である。カメラの露光時間が短いため、細胞内で色素にカルシウムが結合すると、標準的なカルシウム流動アッセイで見られるよりもシグナルが小さくなる。この新しい製剤は、他の市販のカルシウムインジケータよりもかなり明るい色素を提供する。図1に示すように、クエンチ技術はセル内に入らず、細胞外のバックグラウンド蛍光を減少させる。これらの特徴が相まって、シグナルウィンドウが改善され、ビートパターンがより詳細に得られる。

このアッセイキットは、ピーク周波数（BPM）、ピーク振幅および拍動パターンに対する薬理学的化合物の影響を評価するために使用することができ、幹細胞由来の心筋細胞または初代心筋細胞で機能するように設計されている。ピーク周波数は、EarlyTox Cardiotoxicity Dyeによってモニターされた細胞内Ca 2濃度の変化から決定されます。1回の拍動サイクルの間に、筋小胞体が刺激されるとCa2が細胞質に放出される。カルシウムはトロポニンと結合してサルコメアを活性化し、細胞は収縮する。これと同期して、色素が細胞質内の遊離カルシウムに結合し、蛍光シグナルが増加する。筋小胞体のカルシウム取り込みポンプおよび細胞外液とのカルシウム交換によって細胞質からカルシウムが除去されると、細胞の弛緩が起こる。カルシウム濃度が減少すると、蛍光シグナルは減少する。サイクルを繰り返すと、拍動に同期した蛍光ピークがさらに観察される。

カルシウムピーク頻度および非定型パターンの濃度依存性変調は、FLIPR® Tetraシステム上の心筋細胞を用いたEarlyTox心毒性キットを用いて検証および特性化され、ScreenWorks® Peak Proソフトウェアで解析されました。カルシウムピークの頻度、振幅、ピーク幅、立ち上がり時間、減衰時間などのパラメーターの変化を同定することにより、SARの方向性を変えたり、医薬品化学や前臨床開発に進む可能性のある化合物を検討対象から除外したりすることができます。さらに、この方法は心臓に作用する新しい化合物の発見にも利用できる。

材料と方法

このアッセイでは、Cellular Dynamics International社のヒト人工多能性幹細胞由来（iPSC）心筋細胞であるiCell Cardiomyocytesを、同社が提案するプロトコールに従って培養した。セルは実験の10-14日前に384ウェル黒壁透明プレートにプレーティングした。EarlyTox Cardiotoxicity Explorer Kit (R8210)の色素ローディングバッファーは、添加時に心筋細胞の拍動が遅くならないように37℃に加温した。プレート内の25μLの細胞に25μLの色素を添加した。各プレートを5% CO2、37℃で2時間インキュベートした。

プロプラノロール、イソプロテレノール、ソタロールという、キットに含まれる3種類の参照化合物を用いて、iPS細胞心筋細胞に対する様々な作用を調べた。濃度応答を含む化合物プレーティングをComponent Bバッファーで最終濃度5倍に調製し、細胞への温度影響を最小限にするため、添加前に37℃に加温した。FLIPR Tetraシステムで化合物を添加した後、細胞の拍動速度とパターンを最長4～6時間モニターすることができる。化合物添加10分後にプレーティングを再度読み取った。さらに、4 時間後までのいくつかの時点で追加の読み取りを行った。

結果

図2～5に示すように、EarlyTox心毒性キットに含まれるコントロールおよび3種類の参照化合物について、ピーク周波数と拍動パターンを示した。

カルシウム染料の比較

複数のカルシウム指標と、それらが細胞の拍動能力、平均ピーク振幅、およびピーク周波数に及ぼす影響を、4時間にわたって比較した。指標には、EarlyTox Cardiotoxicity Kit、FLIPR ® Calcium 5 Assay Kit（Molecular Devices）、Fluo-4 Direct Kit（Invitrogen）が含まれた。色素は、ベンダーの推奨に従ってiPSC心筋細胞への細胞負荷のためにインキュベートした。FLIPR Tetraシステムで、化合物添加前と添加後の数時点の読み取りを行った。この実験ではコントロールウェルがモニターされた。図 6 および 7 に示すように、全体的なピーク頻度およびシグナル振幅は、EarlyTox Cardiotoxicity Kit で最も高くなりました。図 8 に見られるように、化合物添加後 4 時間では、EarlyTox Cardiotoxicity Dye による細胞の拍動能力（サイレンシング）への影響は見られませんでした。FLIPR Calcium 5 Kitでは多くのウェルでサイレンシングが見られ、Fluo-4 Direct Kitでは化合物添加後90分ですべてのウェルでサイレンシングが見られた。

注文情報

結論

EarlyTox Cardiotoxicity Kitは、幹細胞由来の心筋細胞に対する薬理学的化合物の影響を測定するための、ロバスト性でハイスループットな方法を提供するために最適化されました。最適化された色素製剤は、最大のシグナルウィンドウを提供し、非特異性毒性を大幅に低減しているため、他の市販色素の結果とは異なり、拍動速度、ピーク周波数、シグナル振幅への経時的な影響は最小限です。FLIPR Tetraシステムと組み合わせることで、EarlyTox心毒性キットは、心毒性化合物を排除し、創薬プロセスの早い段階で潜在的な心疾患治療薬の候補を同定することができ、創薬デザインを方向付ける強力なツールとなります。

以下のMolecular Devices®システムと互換性があります。

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