Application Note UV吸光度測定におけるマイクロプレート材料の影響
PDF版（英語）
はじめに
マリー・パプブ｜アプリケーション・サイエンティスト｜Molecular Devices
吸光度測定に使用されるマイクロプレートは、一般的にポリスチレン、環状オレフィンコポリマー（COC）、または石英で作られています。これらの材料はいずれも可視波長域（400-700 nm）での測定には適していますが、紫外（UV）域（<400 nm）では光を吸収する材料もあり、DNA、RNA、タンパク質の直接定量など、260 nmや280 nmでの吸光度測定に基づくアプリケーションには適しません。材料によって透過特性が異なるため、UV吸光度測定に適したマイクロプレート材料の選択は非常に重要です。多くのマイクロプレートに使用されている標準的なポリスチレンは、紫外域の光を吸収するため、バックグラウンドが高くなります。紫外域のバックグラウンドを最小化するために、石英、COC、またはフルオロカーボン（FC）のような「紫外透過性」プラスチックで作られたマイクロプレートがよく使用されます。
このテクニカルノートでは、SpectraMax® ABS Plusマイクロプレートリーダーを用いて、ウェルの底面（マイクロプレートリーダーでの測定中に光が通過する面）がポリスチレン、COC、FCで構成されている複数のマイクロプレートのUV吸光度を評価した。SpectraDrop™マイクロボリュームマイクロプレートは、2枚の石英スライドが入ったホルダーで構成され、2μLまたは4μLのサンプルを挟んで測定します。マイクロプレートの蓋とヒートシールもUV吸光度をテストした。
材料
装置
- SpectraMax ABS Plus マイクロプレートリーダー（Molecular Devices社、商品番号ABS Plus）
- 4s3™ 半自動シートヒートシーラー（Brooks Life Sciences社、商品番号4TI-0655）
マイクロプレート
- SpectraDrop マイクロボリュームマイクロプレート (Molecular Devices 社、カタログ番号 0200-6263)
- UltraVision™ プレート 384 (Brooks Life Sciences 社、カタログ番号 4TI-0214)
- UltraVision プレート 96 (Brooks Life Sciences 社、カタログ番号 4TI-0234)
- Vision Plate 384 (Brooks Life Sciences 社) (#4TI-0204)
- Vision Plate 96 (Brooks Life Sciences 社のカタログ番号 #4TI-0224)
- μClear UV-Star (Greiner Bio-One cat. #655801)
- μClear UV-Star (Greiner Bio-One 社のカタログ番号 #788876)
- μClear CELLSTAR（Greiner Bio-Oneのカタログ番号655090）
- Nunclon Delta Surface（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、商品番号167008）
マイクロプレートカバー
- ユニバーサルマイクロプレートリッド (Brooks Life Sciences社カタログ番号4TI-0290)
- クリアヒートシール (Brooks Life Sciences 社製 cat. #4TI-0541)
| 名称 | 材質 | ベース | 壁色 | ウエル数 |
|---|---|---|---|---|
| スペクトラドロップ マイクロボリュームマイクロプレート | クォーツ | クリア | N/A | 24または64 |
| ウルトラビジョン プレート 384 | COC | ウルトラクリア | ブラック | 384 |
| ウルトラビジョンプレート 96 | FC | ウルトラクリア | クリア | 96 |
| ビジョンプレート 384 | PS | 190 μm クリア | ブラック | 384 |
| ビジョンプレート 96 | PS | 190 μm クリア | ブラック | 96 |
| μClear UV-Star | COC | 135 μm クリア | クリア | 96 |
| μClear UV-Star | COC | 135 μm クリア | ブラック | 384 |
| μクリアセルスター | PS | 190μmクリア | ブラック | 96 |
| ナンクロン デルタサーフェス | PS | クリア | クリア | 96 |
| ユニバーサルマイクロプレートリッド | PS | クリア | N/A | N/A |
| クリアヒートシール | ポリエステル | ポリエステル | N/A | N/A |
表1. 試験したマイクロプレートとプレートカバーの特徴。SpectraDropマイクロボリュームマイクロプレートは、それぞれ2μLまたは4μLを保持できる24または64のサンプルポジションを持つ2枚の石英スライドを含むホルダーで構成されています。
方法
低波長における各種マイクロプレートの光学的透明度を調べるため、各プレートの1ウェルに100μL（96ウェル）または20μL（384ウェル）の蒸留水を入れ、200nmから400nmまで1nm刻みで吸光度を測定した。すべての波長スキャンは、SpectraMax ABS Plus Microplate Reader（バンド幅2 nm）を用い、SoftMax® Proソフトウェアを用いて行った。プレートカバーの効果を調べるため、透明な壁と超クリアな底面を持つ UltraVision™ 96ウェルマイクロプレートを、(a)カバーなし、(b)透明なUniversal Microplate Lidを使用、(b)4s3™半自動シートヒートシーラーを使用し、メーカーの指示に従いクリアヒートシールで密封して測定した。
結果
スペクトルスキャンの結果を図1と表2に示す。試験したすべてのプレート材料は、予想通り340 nm以上の可視域では吸光度が低いが、低紫外域（200～280 nm）と高紫外域（280～340 nm）では吸光度に大きな違いが見られた。
図1. 異なるマイクロプレート材料の吸光度プロファイル。A: 200から400 nmまでのさまざまなプレートのスペクトルスキャン。B: Aの拡大挿入図。最も吸光度が低い5枚のプレートの200～240 nmの吸光度を示す。
| 光学濃度 | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 凡例 | 200 nm | 230 nm | 260 nm | 280 nm | 300 nm | 320 nm | 340 nm |
| 石英_スペクトラドロップ | 0.234 | 0.069 | 0.044 | 0.039 | 0.038 | 0.036 | 0.035 |
| COC_UltraVision (blk/clr, 384) | 1.928 | 0.158 | 0.110 | 0.092 | 0.079 | 0.072 | 0.066 |
| FC_UltraVision (clr, 96) | 0.298 | 0.112 | 0.071 | 0.057 | 0.048 | 0.041 | 0.036 |
| PS_Vision (blk/clr, 384) | 3.562 | 3.685 | 3.209 | 0.665 | 0.108 | 0.070 | 0.058 |
| PS_Vision (blk/clr, 96) | 3.563 | 3.724 | 3.249 | 0.611 | 0.102 | 0.068 | 0.058 |
| COC_UV Star (clr, 96) | 1.156 | 0.077 | 0.056 | 0.044 | 0.039 | 0.036 | 0.034 |
| COC_UVスター（blk/clr、384） | 1.143 | 0.092 | 0.062 | 0.049 | 0.043 | 0.039 | 0.036 |
| PS_Nunclon（細胞培養、96） | 3.809 | 3.843 | 3.519 | 2.617 | 0.371 | 0.180 | 0.117 |
| PS_セルスター（細胞培養、96） | 3.679 | 3.762 | 3.294 | 0.797 | 0.148 | 0.099 | 0.117 |
| PS_ユニバーサルリッド | 3.851 | 4.000 | 3.649 | 2.733 | 0.365 | 0.182 | 0.115 |
| ポリエステル_クリアヒートシール | 4.000 | 4.000 | 4.000 | 3.581 | 3.468 | 0.407 | 0.239 |
表2. 特定の波長における異なるプレート素材の光学的運命。表中の波長における吸光度値は、異なるプレート/カバーで行ったスペクトルスキャンから得られた。
低紫外域では、石英、FC、COCベースのマイクロプレート材料で最高の性能が示され、200～230nmの範囲で大きな違いが観察された。200～240 nmのスペクトルスキャンを拡大した図では、吸光度の違いが明らかです（図1、B）。石英スライドのSpectraDrop Micro-Volume Microplateは、200 nmでのバックグラウンド吸光度が0.2 ODと最も低かった。透明なUltraVision FC 96ウェルマイクロプレート（FC_UltraVision (clear, 96)）は、200 nmでの吸光度が0.3 ODと、試験したマイクロプレートの中で最高の性能を示した。COCマイクロプレートであるμCLEAR UV STAR 96ウェルプレートと384ウェルプレートは、いずれも200 nmで1.2 ODのバックグラウンド吸光度を示したが、230 nmでは0.1 ODに減少した。しかし、3番目にテストしたCOCベースのプレート、UltraVision 384ウェルマイクロプレートは、200 nmで2 ODで吸収し、230 nmで0.2 ODまで減少した。
その他のプレートやカバーは、280 nm以下の波長で2.5以上のOD値で吸収されるため、低紫外域アッセイには適合しないことが判明した。これらのプレートとカバーは、280 nm以上の波長での使用に適しているかもしれない。
μCLEAR CELLSTAR細胞培養マイクロプレートおよび黒壁透明底ポリスチレン・ビジョン・プレートのスペクトルスキャンは、200 nmでOD値3.6の吸光度を示し、280 nmで急激に減少し、320 nmで最小となる（図1、A）。2番目に試験した細胞培養マイクロプレートであるNunclon Delta Surfaceプレートは、200 nmでの吸光度が3.8 ODと高く、310 nmで最小に減少する。乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）アッセイ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD/NADH）アッセイ、リムルスアメーバ細胞溶解液（LAL）を用いたエンドトキシンアッセイなど、340 nmで測定するアッセイは、これらのプレートを用いて正確に測定することができます。
アッセイによっては、ウェル間のコンタミネーションや蒸発を避けるために、マイクロプレートのウェルをカバーする必要があります。様々なタイプのプレートカバーが入手可能で、ここではポリエステル製のヒートシールとポリスチレン製のユニバーサルリッドをテストした。表2に示すように、どちらも200～260 nmの範囲で3.6～4 ODを吸収した。全体的にポリエステル製ヒートシールの方が260 nm以上の波長で吸光度が低く、ヒートシールも蓋も320 nm以上の吸光度がかなり低い。どちらのプレートカバーも320 nm以上での測定に適していると思われる。
結論
ここに示したマイクロプレートとプレートカバーの比較は、異なる素材が紫外域の吸光度に及ぼす影響を浮き彫りにしている。材料によっては、バックグラウンド吸光度が大きくなることがあります。従って、特定の波長または波長範囲でのアッセイに使用するマイクロプレート／カバーを決定する際、検討するマイクロプレートの適合性を評価するために、各波長におけるブランクウェル（例：緩衝液または水のみ）の吸光度を測定することが重要である。例えば、260 nmと280 nmで測定するDNAとRNAの直接定量に使用するマイクロプレートは、これらの波長で最小限の吸光度であることを確認するために試験する必要があります。
例えば、Greiner社はμCLEAR UV STARの至適波長範囲を230 nmまでとしているが、ここでは220 nmまでの吸光度が最小であることが確認された。
通常のポリスチレン製マイクロプレートを使用すると、UV波長で測定したアッセイの結果に悪影響を及ぼす可能性がある。この試験では、SpectraDropスライドの石英ガラス（2μLと4μLのサンプルを測定可能）が、試験した他の材料と比較して、UV領域で最も低いバックグラウンド吸光度を示した。UV領域でより一般的なアッセイ量を測定する場合、FCまたはCOCマイクロプレートは、石英に代わる低コストで、様々なアッセイで一般的に使用される波長で低い吸光度値を示します。
PDF版（英語）