Application Note ClonePixおよびCloneSelect Imaager技術を用いた
ウイルス特異性ハイブリドーマの開発強化

はじめに

二本鎖DNA（ds-DNA）ウイルスはヒトに様々な疾患を引き起こす。ヘルペスウイルス目、アデノウイルス科およびパピローマウイルス科のウイルスは、ヒトに類似した症状を引き起こすことがある。さらに、ウイルスゲノム研究において抗原が保存されているため、特定のウイルスの血清学的およびタンパク質ベースの診断確認が複雑になることがある。プロテオーム解析の高い相同性と血清の交差反応性は、ds-DNAウイルスの個々の種を区別するのに不十分である。この研究の目的は、バイオ医薬品開発に使用される高特異性、非交差反応性モノクローナル抗体を分泌する最適な産生細胞株を同定することであった。

ClonePix®システムは、親ハイブリドーマ材料から数百のサブクローンコロニーのハイスループットスクリーニングに採用されました（歴史的に親株の収量はmAbで1 mg/L未満でした）。生存クローン、高 IgG 分泌クローンは、CloneSelect™ Imaager 技術を使用して、さらに増殖特性を客観的に評価しました。この非常に効率的な自動クローン選別は、免疫原性ウイルス抗原に対する特異性の高い抗体を産生する高力価ハイブリドーマ細胞株のレスキューと安定化を助けた。この技術の組み合わせにより、免疫診断装置の開発に十分な材料が得られた。

材料

• ClonePix®システム(モレキュラーデバイス社)
• CloneSelectイメージャー（モレキュラーデバイス社製）
• ハイブリドーマ／ミエローマ用CloneMedia半固形培地（モレキュラーデバイス社、LLC Cat #K8600/K8610）
• CloneDetect Reagent, Mouse IgG (H+L) Specific, Fluorescein（Molecular Devices, LLC Cat #K8220）

生産不良ハイブリドーマの救済

従来のハイブリドーマ開発法では、骨髄腫細胞株と、目的の抗原で免疫した宿主動物の脾臓細胞を、化学的手法で融合させる。融合されたハイブリドーマは、限界希釈法、それに続く ELISA スクリーニングにより、抗原特異性モノクローナルハイブリドーマ系統の限られた数を単離する、悪名高 く時間がかかり非効率的な選択工程を経る。限界希釈法では、細胞株の活力や生産性が正確に解明されないまま、低い力価の細胞株が生産されます。

最初のds-DNAウイルス特異性ハイブリドーマ細胞株は1990年代に限界希釈法を用いて開発されたため、単クローン性と安定性は最適化されていなかった。長年にわたり、血清や培地組成を変えながら培養（静置培養とローラー培養）を繰り返したが、クローンは不安定であった（図1）。さらに、抗体の収量は3 mg/Lを超えることはなく、精製されたIgGの質は均一ではなく、様々な量の凝集がプレップで観察された。

その目的は、高力価抗体産生な親細胞株をサブクローン化することにより、特異性ハイブリドーマ細胞株をレスキューし、安定化させることであった。クローンピックス・プラットフォームは、半固形メチルセルロース培地とCloneDetect試薬による標識不要検出を利用することで、過去に融合した非常に多くのハイブリドーマを再スクリーニングするという、技術的に大きな利点を提供します（図2）。

ClonePix®システムを用いたハイスループットスクリーニング法により、低生産性の親クローンから高生産性の安定したクローンをレスキューすることができた。

抗体を分泌する高収率標的クローンの迅速な単離

ClonePix®システムは、ワークフローの生産性と費用対効果を大幅に改善し、希少な分泌物を見つける確率を高めることで、限界希釈法と比較してモノクローナル抗体作製に必要な時間を最大50％短縮することを実証しました。

このプロセスでは、親ハイブリドーマクローンを拡大し、続いてClonePix®システムで目的のクローンを分析し、ピッキングした。FITC標識CloneDetect試薬を用いてクローンをイメージャーし、ClonePixソフトウェアを用いて蛍光強度を分析した。FITC陽性クローンは、外観平均強度[FITC]の高い値に基づいてランク付けされ、ピッキングされた。全体として、480個のFITC-IgG陽性クローンがピッキングされたが、これはスクリーニングされた親クローンの総集団のわずか5-6％に相当する。高分泌クローンの大部分は小型（40-60セル）であったのに対し、IgG分泌陰性と判定された大型で成長の速いクローン（70-150セル）は小型であった（図3）。

半固形培地を用いたソースプレートから480個の高分泌体クローンをピッキングし、200μLの液体クローニング培地を封じ込めた96ウェルデスティネーションプレート5枚にデポジットした後、3日間増殖させた。CloneSelect Imaferを使用して、96ウェルプレートでピッキングしたクローンを画像化し、細胞の成長を客観的かつ定量的に評価しました。優れたイメージング速度（96ウェルプレートで90秒以下）により、5日間のコロニー成長を迅速にモニターし、評価することができました。CloneSelect Imagerプロセスを効果的に利用することで、146のトップグロワーが分離された（図4）。

パイロットスケール分析用のサブクローンのスクリーニングと同定

146のトップグロワーを、mAb結合のエピトープを表す合成ペプチドを用いて抗原特異性のスクリーニングを行った。このペプチドは、これまでの研究で抗体に対する強い親和性を示していたため、高親和性抗体を分泌する新規サブクローンのスクリーニングに使用した。

ビオチン化ペプチドをストレプトアビジン表面にローディングした後、146サンプルのハイブリドーマ上清を希釈せずに加え、IgG結合を測定した。特異性の高い上位7つのサブクローンが最適な結合を示し、バンクに選ばれた。

高IgG分泌サブクローンのパイロットスケール生産

価値の高い特異性の高い7つのサブクローンを、将来の分析のために液体培養でスケールアップした。それらは拡張され、十分な培養量が得られた時点で、5つのサブクローンは将来の参考研究のために凍結され、残りの2つの高結合/高IgG分泌クローンは2-3週間拡張され、パイロットスケール生産（1リットル）が完了した。

生産不良のハイブリドーマをレスキューするワークフロー

ds-DNAウイルス特異的抗体の診断開発を進めるためのサブクローンを同定するため、480個のFITC陽性ハイブリドーマクローンを、CloneMatrix半固形培地とFIT標識CloneDetect試薬を含むClonePixテクノロジーを用いてスクリーニングした。CloneSelect Imaferで同定された最も成長の早い146クローンのうち、7つの高産生なクローンが標的ペプチド結合に特異性が高いと判定された。つのサブクローンがパイロット生産とセルバンク用に選択された。このワークフローは、ハイブリドーマのスクリーニング時間を最大50%短縮する一方で、追加研究や生産に適したロバスト性の高い候補を選択します。

モノクローナリティと均一なIgG分泌の検証

ClonePix®システムでリクローニングし、特異性を確認した後、2つのサブクローンをCloneDetect試薬とともに6ウェルプレートのCloneMedia半固形培地に200セル/mLで拡大再プレーティングした。ClonePix®システムソフトウェアによる可視化および解析により、IgGが適切に分泌されていることが示唆され、高産生コロニーの均一性により、より高いIgG収量が観察された（図5）。

新規ds-DNAウイルスハイブリドーマサブクローンの生産能力

クローンピックス・テクノロジー（ClonePix Technology）を利用し、産生不良の親クローンを再スクリーニングし、高産生で安定したサブクローンを救出した。 mAb産生物をプロテインGカラムで精製し、全収量を定量した。図6に示すように、新規サブクローンはいずれも、親クローンの過去の収率 （˶～˶mg/L）よりもIgG産生において劇的な改善（17～25mg/L）を示した。

結論

ClonePixテクノロジーは、手作業による操作を減らすことで、スクリーニングされたハイブリドーマサブクローンのタイムラインと質の両方を改善し、CloneMatrix培地とCloneDetect試薬は、分泌クローンの成長と高感度検出を改善します。ClonePix®システムのデータから、親クローンの生産能力の低さは、抗体産生細胞の小さな亜集団が、増殖の速い非産生細胞に追い越されているためであることが示唆された。

CloneSelect Imaagerと併用することで、ClonePix®システムは、親株ハイブリドーマのこれまでの抗体産生能（0.5～1 mg/L）に比べ、有意に高い抗体産生能（17～25 mg/L）を有する2つの高収率、高親和性ハイブリドーマサブクローンを同定する強力なツールであることが証明された。従って、本技術は特異性ds-DNAウイルスを検出する新規治療抗体の開発に効果的に貢献する。

詳しくはCloneSelect Imager をご覧ください >>