Application Note SpectraDrop™Micro-Volumeマイクロプレートを用いた
少量DNAサンプルの蛍光ベース定量法

はじめに

UV吸光度を用いたDNAの測定は、多くの種類のサンプルの定量を可能にする一般的な方法です。しかし、アプリケーションによっては、調製方法や原料の不足により、非常に少ないサンプル量や濃度の定量が必要となる場合があります。このようなアプリケーションでは、蛍光DNA定量法は感度が高く、より少量のサンプルで低濃度の定量が可能です。

Molecular DevicesのSpectraMax®マイクロプレートリーダー用SpectraDropTMマイクロボリュームマイクロプレートは、プレートあたり最大64サンプルと、他のどの低容量マイクロプレートよりもハイスループットを提供します。2 µLという低容量のサンプルを測定できます。SpectraDropマイクロプレートには、特別に設計されたアダプターと光学的透明度の高いスライドベアが組み込まれており、吸光度モードと蛍光モードの測定が可能なため、ユーザーのアプリケーションニーズに対応できます（図1）。

図1. SpectraDropマイクロプレートの構成。少量サンプル用スライドには、24または64サンプルを入れるスポットまたは「ウェル」を画定するマスクがある。カバースライドには0.5 mmまたは1.0 mmのスペーサーがあり、それぞれ2 µLまたは4 µLのサンプルに対応する。

ここでは、プロメガ社のQuantiFluor dsDNAアッセイを低容量のマイクロプレートフォーマットにアダプターすることで、1サンプルあたり5 pg、つまり2.5 pg/µLの感度で、2µLという小さなサンプルを測定できることを示す。これは、感度が約2000 pg/µLに制限されるDNAの低容量吸光度定量よりも約1000倍感度が高く、吸光度法以上の感度を必要とする次世代シーケンシングなどのアプリケーションに最適です。

少量アッセイ手順

アッセイ手順は、少量セットアップ用に以下のように若干変更した。1pg/µLから1000pg/µLまでの標準物質をTEバッファーで調製した。8チャンネルピペッターを用いて、各標準物質2µLをSpectraDropボトムスライドのウェルにトリプリケートで滴下した。その後、QuantiFluor dsDNA Dye作業溶液を2µLずつ、混合しながらサンプルにピペッティングし、1ウェルあたりの総サンプル量を4µLとした。バックグラウンドの蛍光レベルを測定するために、緩衝液と色素を封じ込めたブランク複製液が含まれた。その後、カバースライドをサンプルの上に置き、プレートを読み取る前に暗所で5分間インキュベートした。

プレートリーダーのセットアップ

SpectraDropマイクロプレートを、フルオレセインフィルター付き蛍光強度検出カートリッジ（FI-FLRH）、またはシグナル/バックグラウンド最適化波長付きTunable Wavelength Selection（TUNE）カートリッジを使って、SpectraMax® Paradigm®マルチモードマイクロプレートリーダーで読み取りました。また、モノクロメーターベースのSpectraMax® M5e マルチモードマイクロプレートリーダーで、最適化された波長を使用して読み取りました。各インストゥルメンテーションの設定を表1に示す。

表1：QuantiFluorアッセイのインストゥルメンテーション設定。

すべてのデータの取得と解析には、SoftMax® Proソフトウェアを使用しました。SpectraDropマイクロプレート用にあらかじめ設定されたQuantiFluorプロトコールにより、データの収集と解析が簡素化されました。SpectraDropマイクロプレートの特異性定義もソフトウェアで利用でき、新しいプロトコルのセットアップを簡素化し、データの正確性を保証します。さらに、SpectraMaxマイクロプレートリーダーは、SpectraDropマイクロプレートの最適化を可能にし、4つのコーナーサンプルのスキャンを使用してプレート定義を微調整し、より正確な結果を得ることができます。SpectraMax Paradigmリーダーでリードハイトの最適化を行い、シグナルの検出を最大化した。

アッセイ直線性と感度

SpectraDropマイクロプレートで検出されたQuantiFluorアッセイは、試験した標準物質の範囲（1～1000 pg/µL）で直線性を示し、標準曲線r2値は0.999でした（図2）。バックグラウンドの標準偏差の3倍を用いて算出した検出下限（LLD）は5 pg/ウェル、すなわち2.5 pg/µLでした。

図2. dsDNA標準曲線 SpectraDrop™マイクロ-ボリュームマイクロプレートをSpectraMaxマイクロプレートリーダーで使用したdsDNA標準曲線。dsDNAの検出下限は5 pg/ウェル、すなわち2.5 pg/µLであった。標準曲線r2 = 0.999。SpectraMax M5eリーダーでも同様の結果が得られた。

まとめ

少量のDNAサンプルを扱う研究者は、少量で高感度のフォーマットで定量する方法を必要とすることが多い。SpectraDrop™Micro-Volumeマイクロプレートは、2.5 pg/µLという低濃度のDNAサンプルの測定を可能にし、低容量吸光光度法の1000倍の感度を実現します。QuantiFluor dsDNAアッセイとSpectraDropマイクロプレートを併用することで、結果の正確性を犠牲にすることなく、サンプルロスを最小限に抑えることができます。

SpectraDropマイクロプレートのスライドは取り扱いが簡単で、すべての光学面に手が届くので洗浄が容易です。スペーサーとスライドの設計により、ウェル間の均一性に優れているため、ウェル間のキャリブレーションは不要です。0.5mmまたは1.0mmスペーサー付きカバースライドと同様に、24ウェルおよび64ウェルサンプルスライドもあり、ユーザーのスループットとサンプル量のニーズに対応できます。SpectraDropマイクロプレートは、SpectraMax Paradigmリーダーを含むSpectraMaxリーダーおよびStakMax®マイクロプレートハンドリングシステムと互換性があります。

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