Application Note iPSC由来3次元神経共培養における神経毒性および神経活性化合物効果の機能評価

はじめに

オクサナ・シレンコ博士｜シニアアプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス社

キャロル・クリッテンデン｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス

カシアノ・カロメウ博士｜リード・ニューロサイエンティスト｜StemoniX社

より複雑で、生物製剤に関連し、予測可能な細胞ベースプラットフォームをアッセイ開発や化合物スクリーニングに使用することへの関心が高まっています。StemoniX® microBrain® 3Dアッセイレディープレートは、ハイスループット3D培養プラットフォームであり、ヒト大脳皮質組織の組織発達と構成により近いものです。各スフェロイドは、単一のドナー源から採取されたアストロサイトと共成熟した、活動的な皮質グルタミン酸作動性ニューロンとGABA作動性ニューロンの混合物から構成されている。このバランスのとれた細胞ミックスにより、シナプスに富んだ神経ネットワークの発達が可能となり、高度に機能的な神経回路が形成される。microBrain 3Dスフェロイドの神経細胞は生理的に活発で、自発的に同期した神経細胞活動がカルシウムオシレーションとして検出される。

FLIPR® Tetraハイスループットスクリーニングシステムを用いた高速カイネティックイメージングにより、カルシウム感受性色素による細胞内カルシウムレベルの変化からモニターされるニューロスフェロイドのカルシウムオシレーションのパターンと頻度を測定した。NMDA、GABA、AMPA受容体の作動薬や拮抗薬、カイニン酸、鎮痛薬、抗てんかん薬など、既知の神経調節物質がテストされた。変化はオシレーションパターンの抑制または活性化として観察され、それぞれの神経調節物質が期待される効果と相関していた。

また、厳選した農薬や難燃剤を含む神経毒性化合物もテストし、化合物の影響に対するアッセイの感度を実証した。このアッセイは、384ウェルプレートでのハイスループットスクリーニング用に最適化され、ScreenWorks® Peak Pro™ ソフトウェアを用いたマルチパラメトリック解析により、神経スフェロイドのオシレーションプロファイルの特性評価を可能にしました。自動的に測定された読み出し値には、オシレーションレート、ピーク周波数、ピーク幅、振幅、波形の不規則性などが含まれます。

細胞生存率およびミトコンドリア完全性に対する化合物処理の潜在的影響を、ImageXpress® Microハイコンテントイメージングシステムを用いたハイコンテントイメージングにより評価した。異なる化合物がCa2+オシレーション速度や細胞生存率に与える影響について、EC50値を決定した。ここでは、ヒトiPSC由来細胞で形成した3D神経スフェロイドを用いた機能的および形態学的アッセイが、カルシウムオシレーションとハイコンテントイメージングの両方を用いて、薬剤候補の評価や神経毒性評価に使用できることを示す。

材料

• StemoniX microBrain 3D Assay Ready 384 ウェルプレート（StemoniX、カタグ番号 BSARX-AA-0384）
• ソルボール™遠心機
• FLIPR Calcium 6 キット（Molecular Devices、cat. #R8190）
• 生存率色素Calcein AM（Invitrogen, cat.）
• ミトコンドリア電位色素 MitoTracker Orange (Invitrogen, cat. #M7510)
• ヘキスト核色素（Invitrogen、cat. #H3570）
• FLIPR TetraシステムとScreenWorks Peak Proソフトウェア（Molecular Devices社製）
• ImageXpress®マイクロコンフォーカルハイコンテントイメージングシステムとMetaXpressハイコンテント画像取得・解析ソフトウェア（Molecular Devices社製）

より複雑で生物学的関連性が高く、予測可能なセルベースプラットフォームの活用

StemoniX microBrain 3D Assay Ready 384-ウェルプレートは、StemoniX社から提供された。このハイスループット3D培養プラットフォームは、ヒトの脳組織の組織発生と体質により近い。このプラットフォームでは、ヒトiPSC由来の直径約600μMの神経スフェロイドは、図1に見られるように、機能的に活性な大脳皮質グルタミン酸作動性ニューロンおよびGABA作動性ニューロン（MAP2で識別；緑色）とアストロサイト（GFAPで識別；赤色）の生理学的に適切な共培養で構成されている。このようにバランスよく細胞が混在することで、シナプスに富んだ神経回路網が発達し、高度に機能的な神経回路が形成される。microBrain 3Dスフェロイドの神経細胞は生理的に活発で、自発的、同期的、容易に検出可能なカルシウムオシレーションを示す。この先進的な神経プラットフォームは、384ウェルプレートでのハイスループットスクリーニング用に最適化され、異なるウェルやプレート間で非常に一貫した機能的性能を示す。

図1. 明視野と免疫染色されたStemoniX microBrain 3Dスフェロイド。A) 明視野像。B)免疫染色されたスフェロイドは、活動的な皮質のグルタミン酸作動性ニューロンとGABA作動性ニューロンをMAP2（緑）、アストロサイトをGFAP（赤）、核をDAPI（青）で識別している。画像はImageXpress® Micro Confocalシステムを用いて取得した。

方法

3D神経培養のセットアップ

StemoniX microBrainプレートは、周囲条件下であらかじめプレーティングされた状態で出荷された。各ウェルには、8～12週成熟した均一な大きさのヒトiPSC由来皮質神経スフェロイドが1個ずつ封入されていた。到着日、プレートを200×gで5分間遠心し、顕微鏡でスフェロイドがプレートのウェル底に沈降していることを確認した後、70％エタノールで除染し、封を開けた。その後、培地を交換し（1/2量、3回）、プレートを37℃、5％CO2インキュベーターに5-7日間置いた。培地交換は2日おきに行った。

ワークフローの図を図2に示す。スフェロイドの存在を確認するため、まず透過光を用いてウェルを撮像した。次に、スフェロイドをFLIPR™カルシウム6色素とともにインキュベートし、カルシウムオシレーションをFLIPR Tetraシステムでイメージングした。次に、細胞を化合物とインキュベートし、生存率を染色し、ImageXpress® Micro Confocalシステムで解析した。

図2. カイネティックおよび細胞イメージング解析による3D培養プラットフォームを利用したマルチパラメトリックワークフロー。1) StemoniX microBrain® 3D Assay Ready 384-Well プレートを培養し、ImageXpress Micro Confocal システムで透過光を用いて観察した。2) スフェロイドをカルシウム感受性色素および神経毒性化合物とインキュベートした。処理後、オシレーション速度の変化をFLIPR Tetraシステムで解析した。3) ImageXpress® Micro Confocalシステムを用いて、染色した細胞の機能・生存率スクリーニングを行った。

カルシウム流動アッセイを用いて、カルシウムオシレーションに対する初期効果を評価した

Sirenko, Grimm et al. 20171 に記載されているように、FLIPR Calcium 6 キットを用いてニューロンの細胞内 Ca2+ フラックスを評価した。細胞内Ca2+フラックスのカイネティクスは、FLIPR Tetraシステムを用いて、470-495 nmでの励起後、515-575 nmで、8 Hzの周波数で10分間測定した。1回の露光時間は0.05秒、ゲインは2000、励起強度は30％に設定した。インストゥルメンテーションの温度は37℃で一定に保った。カルシウムオシレーションに対する初期の影響は、化学物質への最初の曝露から60分後に測定された。初期の時点では、化合物添加の2時間前にFLIPR Calcium 6色素を細胞にあらかじめ添加した。化合物を添加しない場合のカルシウムオシレーションのベースラインは、通常、化合物添加前に測定した。24時間実験では、FLIPRカルシウム6色素添加の22時間前に、細胞を適切な濃度の化学物質に曝露した。FLIPRカルシウム6色素（4倍濃度）をさらに2時間添加し、化合物濃度を同じにするために化合物の量を増やした。定量的データ評価のため、ScreenWorksソフトウェアを用いて、ピークカウント（10分あたり）、平均ピーク振幅、平均ピーク幅（振幅10％時）、平均ピーク間隔（ピーク間の時間）、平均ピーク上昇時間（振幅10％から90％まで）、平均ピーク減衰時間（振幅90％から10％まで）などの代表的な記述子を導出した。

表現型の変化を評価するための生細胞染色

細胞生存率色素Calcein AM（1 µM）、ミトコンドリア電位色素MitoTracker Orange（0.2 µM）、Hoechst核色素（2 µM）の3つの色素を用いてセルを生きたまま染色した。神経特異性マーカーの評価のため、細胞を4％ホルムアルデヒド（Sigma）で固定し、抗MAP2抗体および抗GFAP抗体（BD Biosciences）で染色した。

ハイスループット3Dイメージングと解析を用いた神経毒性の評価

スフェロイドはImageXpress® Micro Confocalシステムを用い、10X Plan Fluor対物レンズでイメージングした。スフェロイドアッセイの方法と撮影設定は既述の通りである2。10～15µM間隔で19枚のZ-スタック画像を取得し、ウェルの底から始めて、各スフェロイドの光透過性部分（深度100～150µM）をカバーするように上に移動した。個々の画像はすべて保存され、3D解析および2Dプロジェクション（最大射影）解析に使用された。画像はMetaXpress® High-Content Image Acquisition and Anlaysis Softwareのカスタムモジュールエディターを用いて解析した。解析方法はSirenko, Mitlo et al.20152に記載されている。MetaXpressカスタムモジュールエディターで作成されたプロトコルを使用して、追加のマルチパラメトリック出力のためのカスタム解析が生成された。まず、カスタムモジュール解析でスフェロイドを同定した。次に、生細胞の数をCalcein AMシグナルの存在によって同定した。第三に、インタクトなミトコンドリアを持つ細胞の数を MitoTracker Orange 染色によって検出した。死細胞は、カルセインAMシグナルの消失または減少によって同定した。同様のアプローチは、神経毒性の評価と3Dでの測定値の導出のための3D画像解析にも使用でき、Sirenko, Hancock et al.

結果

カルシウムオシレーションに対する神経調節物質の影響

microBrain 3Dスフェロイドの神経細胞は、自発的に同期したカルシウムオシレーションを起こす。FLIPR Tetraシステムを用いたカイネティック蛍光イメージャーを用いて、2時間のインキュベーション後の細胞内カルシウムオシレーションレベルの変化をFLIPR Calcium 6色素でモニターしながら、ニューロスフェロイドのカルシウムオシレーションのパターンと頻度を測定した。NMDA、GABA、カイニン酸受容体のアゴニストとアンタゴニストを含む、既知の神経調節物質がテストされた。スフェロイドによるカルシウムオシレーション周波数を、化合物との1時間のインキュベーション後、10分間にわたって測定した。図3Aに6つの化合物のサブセットからのオシレーションパターンを示す。コントロールと比較した場合のオシレーションパターンの違いに注目されたい。各化合物のIC50値と作用機序を図3Bに示す。

図3. 神経活性化合物の評価。A) FLIPR Tetraシステムで評価した10分間のカルシウムオシレーションのサンプルトレース。スフェロイドはFLIPR Calcium 6色素で2時間、化合物で1時間処理した。B) 4パラメータカーブフィットを用いて、10分間のピーク速度の濃度応答曲線から作用機序とIC50値を決定した。

神経毒性作用の評価

多くの工業化学物質や環境化学物質がヒトにおける神経毒性作用を報告している。ここで述べた方法は、カルシウムオシレーションパターンの変化や細胞生存率を評価することで、神経毒性の可能性がある化合物のスクリーニングに用いることができる。神経毒性効果を評価するために、ニューロスフェロイドをいくつかの既知の神経毒性化合物と24時間インキュベートした後、FLIPRカルシウム6色素を2時間負荷した。

カルシウムオシレーションはFLIPR Tetraシステムで測定した。データの一部を図4に示す。コントロールと比較して、神経毒性化合物はカルシウムオシレーションパターンの乱れを引き起こした。具体的には、標記化合物で処理したサンプルでは、ピーク周波数の低下または信号振幅の有意な減少が観察された。

図4. 図4 農薬、工業用化合物、難燃剤の神経毒性影響評価。A) FLIPR Tetraシステムで評価した10分間のサンプルトレース。選択した神経毒性化合物一式をiPSC由来のマイクロブレイン・ニューロスフェロイドと22時間インキュベートした。FLIPR Calcium 6色素を細胞および化合物とともにさらに2時間インキュベートした。カルシウムオシレーションは10分間にわたって記録した。B) 表は、化学物質のカテゴリーと、4パラメータカーブフィットを用いて10分間のピーク速度の濃度応答曲線から求めたIC50値を示している。

ハイコンテントイメージャーを用いた細胞生存能とミトコンドリアの完全性の評価

共焦点イメージングと3D画像解析法を用いて、3D神経スフェロイドの形態と生存率に対する化合物の影響を評価した。細胞毒性効果を評価するために、細胞を様々な化合物で24時間処理した後、生きた細胞をHoechst核染色、Calcein AM、MitoTracker Orange色素で染色した。スフェロイドを、DAPI、FITC、TRITCチャンネルと10X対物レンズを備えたImageXpress® Micro Confocalシステムを用いてイメージングした。コントロールのスフェロイドと、環境毒であるメチル水銀で処理したスフェロイドの画像を図5に示す。イメージングリードアウトの解析は、MetaXpress®ソフトウェアのカスタムモジュールエディターを用いて作成した。まず、解析によってスフェロイドが特定された。次に、カルセインAMシグナルの存在によって生細胞の数を同定した。第三に、インタクトなミトコンドリアを持つ細胞の数を、MitoTracker Orange染色によって検出した。死細胞は、カルセインAMシグナルの欠如または減少によって同定した。

図5. コントロールのスフェロイドと1 mMのメチル水銀で処理したスフェロイドの最大プロジェクション画像。核は青色、カルセインAM染色は緑色、ミトコンドリアはオレンジ色で示す。画像の下に示した画像解析マスクには、スフェロイド（白色）、インタクトなミトコンドリア染色陽性細胞の核（紺色）、ミトコンドリア染色陰性細胞の核（赤色）、陽性細胞の細胞質（水色）のマスクが含まれる。上に示した例では、未処理のスフェロイドでは608個の陽性細胞（インタクトなミトコンドリアを持つ）があった。メチル水銀で処理したスフェロイドでは、陽性細胞の数は228個に減少した。

結論

要約すると、我々はニューロスフェロイドが神経毒性作用の評価に反応し、様々な化合物の神経毒性作用の評価に使用できることを実証した。また、このアッセイはハイスループットなアッセイフォーマットとして、また化合物のスクリーニングとして改良可能であることも示した。

マルチパラメトリック解析により、細胞の形態や生存率だけでなく、神経細胞活性に対する試験化合物の影響をスクリーニングするための有益な情報が得られた。神経毒性評価に使用された表現型記述子には、カルシウムオシレーションのピーク数、振幅、間隔、ピーク幅、およびカルセインAMまたはミトトラッカーオレンジ陽性細胞数が含まれる。化合物の有効濃度をさまざまな測定値について計算し、潜在的な神経毒性の危険性について化合物をランク付けすることができた。この方法は、医薬品、殺虫剤、難燃剤、多芳香族炭化水素など、さまざまな化学物質の代表例を封じ込めた化合物ライブラリーから、化合物の毒性効果を評価するために使用された。

参考文献

1. Sirenko, O., Grimm, F. A., Ryan, K. R., Iwata, Y., Chiu, W. A., Parham, F., Wignall, J. A., Anson, B., Cromwell, E. F., Behl, M.,et al. 器官型ヒト人工多能性幹細胞由来モデルを用いた環境化学物質のin vitro心毒性評価。Toxicol. Appl. Pharmacol. 322, 60-74.
2. Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., and Cromwell, E. F. (2015). 3D 癌スフェロイド培養の生存率と形態を特徴付けるハイコンテントアッセイ。Assay Drug Dev. Technol. 13, 402-414.
3. Sirenko, O., Hancock, M. K., Hesley, J., Dihui, H., Avrum, C., Jason, G., Carlson, C. B., and Mann, D. (2016). 共焦点イメージングと3次元画像解析を用いたiPSC由来肝スフェロイドに対する毒性化合物効果の表現型特性解析。Assay Drug Dev. Technol. 14, 381-394.

その他の情報については、以下の論文を参照されたい。

• Sirenko, O., Parham, F., Dea, S., Carromeu, C., et.al (2018). ヒトiPSC由来神経3次元培養物を用いた機能的・機序的神経毒性プロファイリング。Toxicological Sciences 167(1).
• Anson, B. D., Kolaja, K. L., and Kamp, T. J. (2011). 予測毒性学におけるヒトiPS細胞利用の可能性。Clin. Pharmacol. Ther. 89, 754-758.
• Camp, J. G., Badsha, F., Florio, M., Kanton, S., Gerber, T., WilschBräuninger, L. E., Sykes, A., Hevers, W., and Lancaster, M. (2015). Human cerebral organoid recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 15672-15677.