Application Note Fura-2 QBT カルシウムキット： 均質なFura-2カルシウム測定キット

はじめに

Fura-2色素は、細胞イメージング、GPCRを介した細胞内カルシウムフラックス、およびイオンチャネルの活性化におけるカルシウム動員を測定するための重要なツールと長い間考えられてきた。このレシオメトリック色素は、結合インジケーターと遊離インジケーターの蛍光強度比を計算することで、色素負荷や細胞プレーティングにおけるアッセイの不一致を補正するのに役立つ。しかし、洗浄が必要なため、ウェル間のばらつきが大きくなり、各アッセイに時間と複雑さが加わります。

モレキュラー・デバイセズのFura-2 QBT™Calcium Kitは、実績のあるクエンチベースのテクノロジーとレシオメトリックFura-2カルシウムインジケータを組み込んでおり、検出前の細胞洗浄を省くことでスループットを向上させながら、細胞ベースのばらつきを最小限に抑える均質なアッセイを提供します。さらに、Fura-2 QBT CalciumKitは紫外スペクトルで励起するため、研究者は488 nmで励起する蛍光化合物を軽減することができる。

測定原理

Fura-2 AM は、340 nm と 380 nm で励起され、510 nm で発光するカルシウム感受性インジケーターです。カルシウムイオンと結合すると、色素は380 nmから340 nmへ吸収シフトを起こします。図1は、Fura-2に結合したカルシウムが増加すると、340/510 nmの発光シグナル（緑）が増加し、380/510 nmの発光シグナル（オレンジ）が減少することを示している。発光シグナルの比（挿入プロット）は、濃度応答曲線の最大-最小シグナル応答を測定するために計算される。

Fura-2 QBTカルシウムキットアッセイの調製

この研究では、Fura-2 QBT CalciumKit、Explorerフォーマット（PN #R8197）を使用した。色素は20mM HEPESを含むHank's Balanced Salt Solution（HBSS）に再懸濁した。Probenecid(PBX)を必要に応じて添加し、色素が細胞から漏出するのを抑制した。前夜に384ウェル黒色および透明細胞プレートにプレーティングした接着CHO M1またはHeLa細胞をインキュベーターから取り出した。25μLのアッセイバッファーまたは培地を含むウェルに、25μLのFura-2 QBT色素または競合キットの色素ローディングバッファーを添加した。Fura-2 QBTキット（PN #R8197）またはBDレシオメトリックカルシウムキット（#644243）を負荷したプレートを37℃、5% CO2で1時間インキュベートした。従来のFura-2洗浄プロトコール法も比較研究に使用した。

従来のFura-2洗浄法を使用した場合、50μLの1X色素ローディングバッファーを添加する前に各ウェルから培地を除去し、他のキットと同じ時間と条件で細胞プレートをインキュベートした。FlexStation®3 Multi-Mode Microplate Reader または FLIPR®Tetra Systemで読み取る前に、全プレート をインキュベーターから取り出し、室温まで10分間冷却しま した。従来のFura-2洗浄プロトコール法を用いたプレートは、読み取り前に余分な色素を除去するためにHBSSアッセイバッファーで3回洗浄する必要がありました。

FlexStation 3リーダーおよびFLIPR Tetraシステムを用いた比カルシウム動員アッセイ

HBSS緩衝液＋20mM HEPESに5倍濃度の適切なリガンドを調製し、384ウェルポリプロピレンプレートに入れた。アゴニストはFlexStation 3reader（図2）またはFLIPR TetraSystem（図3）で検出中に、レシオメトリックアッセイに最適化されたパラメータを用いて添加した。色素の励起は波長340 nmと380 nmで行った。

510 nmでの発光シグナルが検出され、添加中と添加後を含めて約90秒間、各ウェルの両方の励起波長について相対蛍光単位（RFU）で測定された。算出された出力は、アッセイ中の各時点における340 nmと380 nmの波長シグナルの比であった。レシオメトリックシグナルのトレースから、最大値-最小値を算出した。グラフおよびEC50/IC50濃度のデータは、ScreenWorks®またはSoftMax®Proソフトウェアからエクスポートし、GraphPad Prismを用いて計算した。Z因子の計算は、Zhangらによる方法を用いて行った。

結果

***図2. Fura-2 QBT カルシウムキットは最大のシグナルウィンドウを提供します。
このキットは、FlexStation 3リーダーでEC80またはIC80において最大のシグナルウィンドウと最も堅牢なZファクターを提供します。

***図3. Fura-2 QBTカルシウムキットアッセイは、アッセイのばらつきを取り除くのに役立つ。
このキットは、より大きなシグナルウィンドウ、EC80またはIC80におけるロバストなZファクター、洗浄ステップを削除することによるアッセイのばらつきの除去を提供することにより、アッセイをさらに強化する。アッセイはUV LEDを備えたFLIPR Tetraシステムを用いて測定された。

結論

Fura-2 QBT CalciumKitは、Molecular Devices社独自のクエンチベースのテクノロジーを使用することにより、洗浄の必要性をなくし、従来のFura-2アッセイに代わる均質なアッセイを提供します。これにより、スループットが向上し、不均一な細胞プレーティングや洗浄中の細胞ロスに関連するアッセイのばらつきが減少し、アッセイコスト（バッファーやばらつきによるアッセイリピートの必要性）が不要になります。BDレシオメトリックカルシウムキットや従来のFura-2ウォッシュアッセイと比較して、Fura- 2 QBTカルシウムキットはEC80およびIC80において最大のシグナルウィンドウと最強のZファクターを提供します。Fura-2色素は紫外域で励起するため、このキットは488 nmで励起すると自家蛍光を発する化合物からの干渉を避けることができます。Fura-2 QBTカルシウムキットは、FlexStation 3リーダーおよびFLIPR TetraSystemでの使用が検証されており、ベンチトップアッセイから完全なハイスループットスクリーンまで、スケーラブルなソリューションを提供します。

以下のMolecular Devicesシステムと互換性があります。

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