Application Note Gタンパク質共役型受容体のGeneBLAzer細胞ベースFRETアッセイ

はじめに

キャスリーン・サロモ｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス

このアプリケーションノートでは、SpectraMax® Paradigm® マルチモードマイクロプレートリーダーでのLife Technologies GeneBLAzerアッセイの使用について説明します。黒壁クリアボトムプレートで、様々なプレートリーダー設定を用いて最適な分析条件を評価した。

GeneBLAzerアッセイは、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）ベースのメソッドであり、in vivo（生細胞）またはin vitro（細胞溶解液）でGタンパク質共役型受容体やその他の創薬標的を研究する。GeneBLAzerテクノロジーは、FRETベースの基材（CCF2またはCCF4）を介して検出される哺乳類細胞内のβ-ラクタマーゼレポーター活性に基づいています。基質にはクマリンとフルオレセインの2つの蛍光色素が封入されている（図1）。β-ラクタマーゼが発現していない場合、基質は無傷のままである。この状態では、クマリンが励起され、FRETが起こり、エネル ギーがフルオレセインに移動してフルオレセインが励起され、緑色 の光が放出される。しかし、β-ラクタマーゼが発現すると、基質が切断され、2つの蛍光色素が分離し、エネルギー移動が阻害される。クマリンのみが励起され、青色発光となる。レポーター応答は、青：緑の比として表される。この正規化されたレシオメトリック測定により、実験ノイズが最小限に抑えられ、細胞数やトランスフェクション効率のばらつきなどのエラーが起こりにくくなる。

図1. GeneBLAzerテクノロジーの仕組み。

CCF-2基質にはクマリンとフルオレセインの両方が封入されている。無傷の基質中のクマリンが励起されると、フルオレセイン部分にFRETが起こり、緑色の光が放出される。BLAを発現させると、基質が切断され、クマリンの励起が青色蛍光シグナルとなるようにエネルギー移動が阻害される。その結果、青色：緑色の比率が正規化されたレポーター応答を提供する。

SpectraMax Paradigmリーダーは、デュアル光電子増倍管（PMT）により、高速読み取りとFRETシグナルの精度向上を実現している。このリーダーはユーザーによるアップグレードが可能であるため、ユーザーのニーズに応じて光学検出カートリッジを構成することができる。これは、アッセイに柔軟なマルチモードカートリッジとアッセイ特異性カートリッジから構成される。蛍光強度（FI）GeneBLAzer検出カートリッジは、インビトロジェン社のGeneBLAzerアッセイ用に開発されたもので、基質のFRETドナー部分を励起するための超高輝度LEDと最適化されたフィルターセットが含まれており、アッセイに優れた感度を提供します。さらに、HTSアプリケーションに対応するため、リーダーは最大1536ウェルマイクロプレートフォーマットをサポートし、オプションのStakMax®マイクロプレートスタッカーまたは他のロボットプラットフォームと統合することができる。オンザフライ読み取りにより、高いデータ品質を維持しながら、プレートの読み取り時間を短縮できる。

材料と方法

アッセイ準備とインストゥルメンテーション

GeneBLAzer M1 CHO-K1 DA細胞（ThermoFisher、K1365）をカルバコール（塩化カルバモイルコリン、Sigma C4382-10G）で処理し、Gタンパク質の活性化を刺激した（図2）。活性化段階は、LiveBLAzer-FRET B/G Loading Kit（ThermoFisher, K1095；CCF4-AM基質を使用）を用いてSpectraMax Paradigmリーダーで測定した。最適化されたプレートリーダーの設定を表1に示す。

図2. GeneBLAzer CHO-K1 DA細胞におけるGタンパク質活性化の刺激。セルは右から左へ、濃度の増加するカルバコールで刺激された。

表1. SpectraMax ParadigmリーダーとGeneBLAzer検出カートリッジのインストゥルメンテーション設定。

データ解析

データとカーブフィット処理は、SoftMax® Proソフトウェアを用いて行った。青：緑の比率とZ´ファクターの計算は、以下の式で求めた：

ここで、pは陽性対照、nは陰性対照を示す。

結果

プレートタイプの比較

アッセイ性能を比較するため、様々なプレート素材とウェル密度でセルを増殖させた。プレートの特性と詳細を表2にまとめた。試験したマイクロプレートはすべて、Z'ファクターが0.8を上回り、同程度のEC50値を示した（図3）。最も高いアッセイウインドウを持つ用量反応曲線は、1536ウェルのSCREENSTARマイクロプレートで観察された。使用したトランスフェクトCHO細胞の接着と増殖には、標準的な組織培養処理（CELLSTAR）で十分であった。GeneBLAzer 検出カートリッジを搭載した SpectraMax Paradigm リーダーは、微弱な FRET シグナルも検出できるほど高感度であったため、アッセイ性能に妥協することなく、GeneBLAzer アッセイを 1536 ウェルフォーマットに小型化することができた。384ウェルプレートと1536ウェルプレートの両方が同等の結果を示し、本試験でテストしたセル株とGeneBLAzer試薬に使用することができる。

表2. 使用したプレーティング。

図3. 異なるPlateタイプを使用した結果の比較。プレーティング。データは4パラメータ（対数）カーブでフィット処理した。

測定速度の比較

SpectraMax Paradigmリーダーには、読み取り速度に関する3つのオプションがある。1536ウェルのμClearプレートを用いて全オプションをテストし、許容できるEC50およびZ´因子を維持しながら、可能な限り最速の読み取り時間を決定した。

リーダーには以下の読み取り速度がある：

• ストップ＆ゴー：プレートの移動がなく、ウェル中心がプレートリーダーのリードヘッドの下に位置している間にシグナルを検出する。信号の積分時間はユーザーが設定する。本実験では、ウェルあたり140msに設定した。
• On-the-fly: プレートが移動している間、ウェル中心部のシグナルを検出。信号積分時間は固定。

1. 1. 1. 速度の最適化：可能な限り最速の読み取り時間を得るように設計されています。
      2. 性能の最適化：読み取り速度を下げて品質を向上。

結果を図4にまとめた。異なる読み取りモードのEC50値とZ´ファクターは同程度である。したがって、このアプリケーションでは、可能な限り高速の読み取り速度であるOn-the-fly optimized for speedを使用することで、プレートの読み取り時間を最小限に抑え、結果をより早く得ることができます。

図4. 1536ウェルプレート用SpectraMax Paradigmリーダーの読み取り速度の比較。データは4パラメータ（対数）カーブでフィット処理した。

結論

本アプリケーションノートでは、SpectraMax Paradigm リーダーを用いた GeneBLAzer アッセイの優れた性能を示す。アッセイを1536ウェルフォーマットに小型化し、最速の測定速度を使用することで、結果を損なうことなく1536プレートの総読み取り時間をわずか1分に短縮できる。

参考文献

Zhangら、J Biomol Screen、1999年4月第4巻第2号、67-73頁。