Application Note FLEXStationシステムを用いたGq共役型受容体アッセイ： M1ムスカリン受容体

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はじめに

Gq共役型レセプターは膜貫通タンパク質で、細胞外のシグナルを細胞内に伝達し、最終的に遺伝子発現を変化させる役割を担っています。Gq共役型レセプターの中には、リガンドや薬剤がタンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合することで活性化されるものがある。この相互作用は、細胞内貯蔵小胞から細胞質へのカルシウムの動員などの下流事象を引き起こす。Gq共役型受容体の不適切な機能は、癌、神経変性疾患、心血管疾患に関与している。従って、正常時と疾患時の受容体機能を比較することは重要である。

これらの研究で用いた細胞株M1 CHOは、M1ムスカリンGq共役型レセプター1を安定的にトランスフェクトしたものである。この受容体はカルバコールで刺激され、小胞体から細胞質へとカルシウムが放出される。M1 Gq共役型レセプターの活性化は、FlexStation® Microplte Readerとカルシウム感受性蛍光色素Fluo-3、またはMolecular Devices社のFlexStation Calcium Assay Kitを併用してモニターすることができます。その結果、カルバコールは両検出法で同程度の EC50値を示した。

FLEXstation SYSTEMは、アッセイ開発および基礎研 究のための多用途ツールです。

  • シンプルで迅速な実験セットアップとデータ解析
  • EC 50およびIC 50値の決定
  • Z´ファクターが示すように、アッセイ開発に最適

方法

黒壁透明底96ウェルマイクロプレート（E&Kディストリビューター、cat# 655090）の1ウェルあたり100 µLの容量に、1ウェルあたり30,000個の濃度で実験前夜にセルを播種した。FlexStation Calcium Assay Kit（Molecular Devices, cat#R8041）の1X Loading Bufferで30分インキュベートした後、FlexStationでカルバコール を分注し、細胞質へのカルシウム動員をモニターした。すべての実験は、M1 CHO細胞に存在する内因性排出ポンプを阻害するため、最終濃度2.5 mMプロベネシドで行った。


EC50値の決定

セルは、アゴニストのHalf-log希釈液を用いて、カルバコール（0～1 µM）の範囲で曝露された。結果は、少なくとも2日間にわたって行われた少なくとも4回の独立した実験の代表値である。ローデータは「最大-最小」および「絶対」RFU値として分析した（図1、2）。C "値は最大反応の50％を引き起こす薬物濃度（EC50値、図3参照）である。4パラメータのカーブフィット処理を用いて、レプリケートサンプルの平均値をグラフにプロットした。Fluo-3を用いたカルバコール のEC50値は19-39 nMの範囲であったが、FLEXstation Calcium Assay Kitでは12-30 nMであった（図3および4参照）。


Z´因子の決定

マイクロプレートの半分のセルを0.5 μM カルバコールで処理し、もう半分のプレートは1X Reagent Buffer（1X HBSS/20mM HEPES pH 7.4）で処理した。FLEXstation Calcium Assay Kitを用いて、カルバコールが介在するカルシウム動員をモニターした（図5）。Z´ファクターは式2を用いて計算した：

σc-とσc+はそれぞれ陰性対照と陽性対照の標準偏差を示し、｜μc+ - μc-｜は陽性対照の平均値と陰性対照の平均値の差の絶対値を示す。FlexStation Calcium Assay Kitを用いてFLEXstationで得られたZ´因子は0.65であった。これは陰性対照と陽性対照の間に大きな分離帯があり、最適化された高品質のアッセイ法であることを示しています。

まとめ

FLEXstationは、Gq共役型レセプターの活性をモニター するためのカルシウム動員アッセイで再現性の高い結 果を生み出します（図3）。第一に、カルバコールで得られたEC50値は、検出法、Fluo-3およびFLEXstation Calcium Assay Kitの間で一貫していた。また、同じ日に分析したアッセイでは2倍以下の差しかなく、異なる日に分析したアッセイでは4倍以下の差しかなく、FlexStation Systemの信頼できる性能がさらに実証された（データは示さず）。最後に、Z´因子の決定から、FLEXStationが検討したモデル系に対するアッセイ開発のための優れたツールであることが示されました。さらに、インストゥルメントのセットアップとデータ解析が簡単に行えるSOFTMax® PROソフトウェアなどの利点もあります。さらに、デュアルモノクロメーターにより、アッセイ開発や基礎研究目的の柔軟性が向上します。結論として、FLEXstationは基礎研究およびアッセイ開発ラボの目標達成を支援する、使いやすく多用途なツールを提供します。

より詳細な情報については、Molecular Devices社のウェブサイト www.moleculardevices.com/pages/flex_lit1.html からダウンロード可能なアプリケーションノート "Comparison of FLIPR® and FlexStation® Systems for Calcium Mobilization Assays "をご参照ください。

参考文献

  1. Buck, M. A., and C. M. Fraser. 1990. Biochem. Biophys. Res. Commun. 173: 666- 672.
  2. Zhang, J-H., T.D.Y. Thomas, and K. R. Oldenburg. 1999. J. Biomol. スクリーニング 4: 67-73.

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