Application Note 血管新生モデルを用いた
ハイコンテントチューブ形成アッセイ

腫瘍血管新生を標的とした自動チューブ形成アッセイのスケールアップ

Eurofins Panlabs Discovery Services Taiwan, Ltd.

既存の血管から新しい血管が形成される血管新生は、内皮の発芽、増殖、遊走、浸潤、分化など様々な生物学的プロセスに関与する重要なステップである1, 2。血管新生の異常は疾病状態の特徴であり、広範な臨床的意義に関係している3-5。これらの中で、腫瘍の血管新生を標的とする治療薬は、腫瘍の成長を抑制する有望な代替的アプローチである。

腫瘍に対する治療薬を開発する特異性のためには、抑制性または刺激性化合物に対する内皮細胞の反応を評価するために、生理病理学的環境を再現したロバスト性のin vitro血管新生モデルが不可欠である2。チューブ形成アッセイは、in vivoの微小環境を代表するモデルの一つであり1, 6, 7、細胞外マトリックス中で増殖した内皮細胞由来の毛細血管様チューブ構造を定量化することにより、抗血管新生効果を迅速に評価することができる（図1）。

このアプリケーションノートでは、同様のアッセイをスケールアップする際の大きなボトルネックとなっている画像取得と解析を効率化する自動チューブ形成アッセイの開発について述べる。蛍光染色とハイコンテントイメージングシステムを組み合わせることで、インタクトな3D細管構造をよりよく可視化することができ、細管形態に対する血管新生阻害効果を特徴付けるために複数の表現型測定を行うことができる。抗癌剤スラミンを用いて、アッセイのスループット、感度、一貫性を保証する我々の方法のロバスト性を実証した。

材料

• ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC) (ATCC, Cat #CRL-1730)
• 96ウェル細胞培養プレート
• マトリゲル（コーニング）
• クリスタルバイオレット (MilliporeSigma)
• カルセインAM (Thermo Fisher Scientific)
• Suramin（ミリポアシグマ社製）
• ImageXpress®マイクロコンフォーカルハイコンテントイメージングシステムおよびMetaXpressハイコンテント画像取得・解析ソフトウェア（Molecular Devices社製）

方法

HUVECを96ウェルマイクロプレートにあらかじめ固めたマトリゲル上に、1ウェルあたり15,000セルでプレーティングした。播種直後、HUVECを0.4%ビヒクルまたは1.25μMから80μMまでの一連のSuramin希釈液で処理した。37℃、5% CO2で18時間培養後、細胞をカルセインAMまたはクリスタルバイオレットで染色した。このプレートをImageXpress® Micro Confocalシステムで、2X Plan Apo対物レンズと、Calcein AMとCrystal VioletそれぞれのFITCとCy5フィルターセットを用いてイメージングした。チューブはマトリゲル中で3次元ネットワークを形成しているため、z軸に沿って1.3 mmの範囲にわたる一連の画像を取得した。Best-Focusアルゴリズムにより、各Zスタック画像からチューブ構造をリアルタイムで2次元画像に投影し、得られた画像をMetaXpress®ソフトウェアのカスタムモジュールで解析した。カスタムモジュールは、個々の管状または結節状の構造を抽出・同定し、総管長、総管面積、管番号、結節番号を読み出しデータとして出力した（図2）。

Suraminの抗血管新生作用を決定するために、Suraminで処理したウェルの結果をビヒクル処理および無細胞ウェルと比較した。血管新生阻害に対するSuraminの有効性は、総管長をビヒクルコントロールの管長と正規化することにより決定し、4パラメータ非線形回帰を用いて用量系列をフィッティングした。最小阻害濃度（MIC≧30％）を有意な反応としてスコア化し、それに応じて半値最大阻害濃度（IC50）を算出した。

蛍光生着染色を用いたチューブの可視化と定量化の改善

クリスタルバイオレットで細胞を染色し、光学顕微鏡で目視検査することは、チューブ形成を測定する最も典型的な方法である。内皮細胞は基底膜のような基材の中で三次元的なネットワークに成長する性質があり、明視野顕微鏡には本質的な限界があるため、不均一な照明下ですべてのチューブ構造を正確に捉えることは困難である（図3A）。その上、手作業による管形成の測定は手間がかかり、人為的なバイアスに左右される。このような落とし穴はアッセイの性能を損ない、同様のアッセイのスケールアップの可能性を制限する。

われわれは、蛍光染色と低倍率対物レンズを用いて管状構造のウェル全体像を取得することで、これらの限界を克服した。クリスタルバイオレット（Crystal Violet）染料の明視野画像と比較すると、カルセインAMの蛍光またはクリスタルバイオレットの自家蛍光は画像のコントラストを改善し、得られた画像はほとんどビネットがない（図3B）。低倍率対物レンズの長い被写界深度と自動化されたzスタッキングも、三次元的に成長したより多くの細管を捉えるのに役立っている。さらに、カルセインAMバイタル色素染色は、サンプル固定の必要性をなくし、チューブ破損やその他のアーチファクトの原因となりうる洗浄ステップを減らす。

この修正プロトコルの性能を示すために、線維芽細胞増殖因子および血管内皮増殖因子（VEGF）受容体シグナル伝達を標的とすることにより血管新生を阻害することが知られている化合物であるSuraminを陽性対照として用いた。3Dスタックから投影された蛍光イメージャーの自動セグメンテーションにより、管状構造と結節状構造を明らかにし、定量化することができる（図4）。統計解析によると、スラミンは、Z'ファクター0.75の濃度依存的な方法で、全チューブ長で示されるチューブ形成を有意に阻害した（図5）。これらの結果は、明視野イメージングと手作業による定量を用いた結果と同等であるが、アッセイ時間は96ウェルプレートで8時間から30分未満へと大幅に短縮された。

結論

ハイスループット・スクリーニングで数多くのチューブ形成アプリケーションが可能である。

チューブ形成アッセイは、in vitro 3D血管新生ツールとして、様々な内皮細胞ソースの選択、異なる細胞タイプの共培養、増殖培地の代替サプリメント、様々なタイプの3Dマトリックス支持層、幹細胞への血管新生誘導の適用などの実験に適応できる6, 8-10 。

しかしながら、チューブ形成アッセイをスケールアップすることは、画像取得から処理、解析に至るまで大きな困難を伴う。ここでは、抗血管新生化合物のスクリーニングのために、HUVECにおけるチューブ形成の最適化されたハイスループット定量化について要約する。蛍光染色、Z-スタック画像取得、ウェル全体画像の2Dプロジェクション生成、および管とノードを定義するための独自の画像処理アプローチで設計されたカスタムモジュールを利用することにより、管状ネットワークの信頼性の高い自動解析を提供することができた。イメージングと解析を自動化することで、解析結果の偏りを回避し、手動または半自動での定量化という時間のかかる問題を徹底的に解決した。ImageXpress®マイクロコンフォーカルシステムを使用することで、手順が容易になり、チューブ形成アッセイの信頼性、再現性、ハイスループットが可能になった。

参考文献

1. アドバンス ドラッグ デリヴ レヴ 97:250-9.
2. Iran J Basic Med Sci.
3. 血管新生 18: 433-48.
4. Nat Med. 9: 653-60. 2003
5. 2011年 Annu Rev Cell Dev Biol.
6. Stem Cell Res Ther.
7. Drug Discov Today.
8. J Endod. 43: 588-595.
9. アッセイ医薬品開発技術. 15: 267-279.
10. Reprod Toxicol. 70: 116-125.