Application Note SmartInjectテクノロジー搭載SpectraMax
インジェクターカートリッジを用いた高感度ATP定量

はじめに

アデノシン5´-三リン酸（ATP）はすべての生きた細胞に存在する。そのレベルは厳密に管理されているため、ATPの測定は生存細胞数の指標として使用することができる。ATP測定は、食品、医薬品、ヘルスケア、パーソナルヘルスケア産業における細菌汚染に対する原材料や製造工場の衛生監視、および廃水分析に用いられている1。バイオテクノロジーや製薬業界では、ATP測定は細胞増殖や細胞毒性の評価に用いられています。ATPの生物発光アッセイは、その感度の高さと利便性から非常に普及しています。このアプリケーションノートでは、SpectraMax i3xマルチモードマイクロプレートリーダーとSpectraMaxインジェクターカートリッジおよびSmartInject™テクノロジーを用いて、20amol/ウェルまでのATPの高感度検出と50十年のダイナミックレンジを実証します。

アッセイ原理

この酵素は、ルシフェリンのATP依存性酸化を触媒し、同時に光を放出する（図1）。ATPが反応の制限成分である場合、放出される光の量はATPの濃度に比例する。放出された光の強度は、SpectraMax i3xリーダーで簡単に測定できる。SpectraMax インジェクターカートリッジは、このアッセイに最適な感度を得るために必要な、正確な試薬の供給と遅延時間および積分時間の調整を可能にする。

材料と方法

• ENLITEN ATPアッセイシステム（プロメガ社、商品番号FF2000）
• ソリッドホワイト96ウェルマイクロプレート（Greiner cat、商品番号655075）
• SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー
  ◦SpectraMax インジェクターカートリッジ

アッセイセットアップ

96ウェルフォーマットに対応するために若干の変更を加えた以外は、キットに付属の説明書（テクニカルマニュアル品番TMF004）3に従った。

注：テクニカルノートには、微生物や哺乳類細胞からのATP抽出を含むサンプル調製に関する記述もあるが、本アプリケーションノートでは扱わない。

1. 酵素液と緩衝液を解凍し、氷上に保存した。rL/L試薬は、Reconstitution BufferをrL/L試薬バイアルに注ぎ、静かに数回振り混ぜ、室温で1時間放置することにより再構成した。
2. 感度とダイナミックレンジを測定するために、まず100 µLのATPストックスタンダードを900 µLのATP非含有水で希釈し、その後ATP非含有水で1～10倍に連続希釈してATPスタンダードを調製した。希釈したスタンダード（10 nM～0.0001 nM）は、使用するまで氷上に保存した。
3. 希釈したATPスタンダード（またはATPフリー水ブランク）をマイクロプレートウェルにトリプリケートでピペット注入した（10 µL/ウェル）。最終的なATP含量は0.01～1000fmol/ウェルであった。

インストゥルメンテーションの設定

装置の設定は、簡単に設定できるグラフィカルなワークフローを提供するSoftMax ProソフトウェアのAcquisition Viewを使用して選択した（図2）。ソフトウェアのProtocol Libraryには、設定済みのATPアッセイプロトコールも用意されています。新しいSmartInjectテクノロジーを使用して、インジェクターから試薬を供給すると同時にアッセイプレートを振とうし、試薬が完全に混合されるようにした。

1. エンドポイントアッセイに最適な設定を決定するための高速カイネティックアッセイでは、SmartInjectを選択し、ATP希釈液（10 µL/ウェル）を含む選択したウェルにrL/L試薬100 µL（インジェクター1）を注入し、0.5秒間隔で連続的に積算を開始し、合計10秒間積算しました。
2. 感度とダイナミックレンジを測定するエンドポイント測定では、SmartInject Technologyを使用して1ウェルあたり100µLの試薬を注入し、2秒間の遅延と10秒間の読み取りを行いました。
3. インジェクター1にrL/Lの試薬を注入するには、インストゥルメンテーションのタッチスクリーンで「Prime」をタッチします。これで 260μL の試薬が供給され、完全なプライムには十分であった。
4. ATP標準物質を封じ込めたプレートをSpectraMax i3xリーダーのプレート引き出しに入れ、「Read」ボタンをクリックして注入／読み取りサイクルを開始した。

インジェクターの洗浄

溶媒供給システムの汚染除去は、満足のいくATP測定結果を得るために極めて重要です。エタノール洗浄だけでは十分ではありません。システムを滅菌するだけでなく、ブランク値を可能な限り低く維持するために、あらゆるソースからの残留ATPを破壊する必要があります。

インストゥルメンテーションのタッチスクリーンの洗浄機能は、除染に必要なパラメータに合わせて設定された。インジェクター1は、少なくとも250μLの50％漂白剤（2.5～3％次亜塩素酸ナトリウム）をインジェクターに送液し、1時間放置した後、少なくとも2.5mLの脱イオン水で洗浄し、洗浄・滅菌しました。次に、少なくとも250μLの75%エタノールをポンプで注入し、1時間静置した後、少なくとも2.5mLの脱イオン水で洗浄した。最後に、インジェクターに空気を送り、ラインからすべての液体を除去した。

結果

ATP反応プロファイル

ルシフェリン/ルシフェラーゼ試薬添加時の反応プロフィールを図3に示す。1000 fmol ATP/ウェル存在下での発光（上のプロット）は1秒以内に最大となり、少なくとも10秒間はそのレベルを維持した。ブランク（下のプロット）では、基本的に反応は見られなかった。このデータに基づくと、2秒の遅延で十分であり、データインテグリティの時間は1秒程度まで短縮でき、プレート全体を読み取るのに必要な時間を短縮できる。

ダイナミックレンジと感度

ATP濃度が0.01～1000fmol/ウェルの標準曲線を図4に示す。計算上の検出限界（ゼロ以上のブランク値の3正のSDより高いシグナルを産生する量）は約20amol/ウェルでした。ダイナミックレンジは約5 logであった。

概要

SpectraMax i3xリーダーとSpectraMaxインジェクターカートリッジを使用したENLITEN ATPアッセイシステムにより、ATPが1ウェルあたり20 amolまで、ダイナミックレンジ50dyで検出された。このレベルの感度により、ユーザーは食品、飲料、化粧品、その他の製品に含まれる細菌やその他の微生物汚染、およびATPを分解する酵素を確実に検出することができる。

アッセイのセットアップは、SoftMax Proソフトウェアの設定済みプロトコルで簡素化されており、標準曲線を自動的にプロットし、サンプルデータを分析します。SoftMax ProソフトウェアのAcquisition Viewでは、グラフィカルなインターフェースを使用してアッセイワークフローを簡単に設定できます。SmartInjectテクノロジーは、ウェル間のばらつきを最小限に抑え、アッセイ感度を最適化するために重要な、試薬の完全な混合と発光シグナルの迅速な発現を確実にするために、注入と混合を同時に行います。

参考文献

1. Jones, D. 1998. ATPを用いた生物発光アッセイ。Luminescence Forum, 4: 1-9.
2. DeLuca, M.A. and W.D. McElroy, (1978) in Meth. Enzymol., 53:3.
3. プロメガ社: www.promega.com

SpectraMax i3x Multi-Mode Detection Platformについてさらに詳しく >>