Application Note 創薬・開発におけるクローンスクリーニングのための
ハイスループットIgG定量プラットフォーム
- 迅速、ホモジニアス、自動化に適したアッセイで、96検体について15分以内に結果が得られます。
- 少ないサンプル量と限られた前処理で、粗基質サンプルの分析が可能
- 2.5～2000mg/LのIgGを正確に測定
PDF版（英語）
はじめに
キャシー・オルセン博士｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス
ハンナ・バーン博士｜生物製剤部門責任者｜バリタセル社
生物学的製剤は、製薬業界において最大かつ最も急成長している分野であり、売上高は5,000億ユーロ、年間成長率は8％である。生物製剤の製造工程は、臨床試験であれ上市であれ、すべて細胞株開発から始まる。モノクローナル抗体（mAb）は、バイオ医薬品を代表する治療法としての地位を確立している。ロバスト性のある製造プラットフォームを確立することは、抗体探索の努力をシームレスに臨床的・商業的成功に結びつけるための鍵である。mAb（IgGなど）の力価を正確かつ確実に測定することは、すべての生物製剤の製造において最適な細胞培養性能を確保するために、開発およびその後の製造において不可欠である（図1）。バイオプロセス全体を通してリアルタイムでタンパク質力価を確実にモニターする能力により、オペレーターはプロセス時間を最小限に抑えながら、タンパク質アウトプットを最大化するためにプロセス条件を迅速に調整することができる。力価データへの迅速なアクセスはまた、下流工程の準備に関する早期の決定を可能にし、生産タイムラインをさらに短縮します。
図1. 細胞トランスフェクションからスケールアップまでの細胞株開発プロセス。生産性が高く、長期間安定した発現を示し、製品の品質が良好なクローンは希少であるため、細胞株作製プロセスは非常に複雑で、面倒で、時間がかかる。それゆえ、スクリーニング戦略は生物学的製剤製造のすべての段階で実施される。治療可能性のある新しいmAbを開発する上で最も時間がかかるステップはクローン選択であり、これは今日、従来のスクリーニング技術によって妨げられている。さらに、現在のワークフローは単機能でコストが高く、専門的なトレーニングが必要である。
現在、バイオ医薬品業界が採用しているmAbsの定量化には様々な技術があるが、ゴールドスタンダードであるプロテインA HPLC、バイオレイヤー干渉法、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、免疫比濁法アッセイなどが一般的な方法である。これらはすべて、検査1回あたりのコスト、ハードウェアのコスト、実験実行に必要なスタッフの経験など、明確な特徴を持っている。重要なことは、これらの手法の中には、全細胞、細胞残屑、混入物を除去するための遠心分離や希釈など、分析用のサンプルを調製するための様々な工程を必要とするものがあることである。産業界で広く採用されているにもかかわらず、高輝度コスト（Protein A HPLC）、結果のばらつきにつながる細胞コンタミネーションへの敏感さ、人為的ミスのしやすさ、手間のかかるワークフロー（ELISA）、結果までの時間のかかりやすさ（場合によっては3時間以上）は、IgGの定量にProtein A HPLCとELISAをバイオプロセシングワークフロー全体で採用しようとするユーザーにとって、依然として大きなハードルとなっている。
ここでは、ValitaCellのValitaTiter IgG定量アッセイとMolecular Devicesの蛍光偏光（FP）設定マイクロプレートリーダーを組み合わせた、完全に最適化された迅速、ロバスト性、正確なIgG力価測定プラットフォームの概要を紹介する。ValitaTiterアッセイシリーズは、2.5～100mg/Lまたは100mg/L～2000mg/LのIgG濃度を、試薬添加と測定のシンプルなプロトコールで測定します。ValitaTiterプレートには、蛍光標識された標的特異性プローブがプレコートされており、IgGテストサンプルを添加する前にユーザーが再構成します。アッセイは15分以内に実行され、96または384ウェルプレートフォーマットでバイオプロセスのワークフローに組み込むことができる。アッセイはハイスループットで、完全自動化が可能です。分析は、最大10 x 106 cells/mLの粗細胞培地中で、少ないサンプル量と限られた前処理で実施できる。アッセイ検出は、Molecular Devicesマイクロプレートリーダーで蛍光偏光を用いて行うことができます： SpectraMax® iD5、i3x、Paradigm®、M5マルチモードマイクロプレートリーダー。(i3xおよびParadigmリーダーには蛍光偏光検出カートリッジが必要です）。
SpectraMaxマルチモードマイクロプレートリーダーは柔軟性に優れており、吸光度、蛍光、発光に加え、蛍光偏光（FP）、時間分解蛍光（TRF）、FRETの設定可能なオプションが用意されています。ウェスタンブロット、細胞イメージング、高速カイネティクス用インジェクターなど、アップグレード可能なモジュールも用意されている。
| バリタ®タイター | 表面干渉法 | ELISA | HPLC | |
|---|---|---|---|---|
| 総アッセイ時間 [96 サンプル］ | <15分未満；30分未満 | 55-65分 | 6時間以上 | 25-45時間 |
| サンプル量 [μL］ | 5-30 | 180+ | 100 | 1000-2000 |
| 測定範囲 [mg/L］ | 2.5-100; 100-2000 | 0.025-2000 | 0.5-5 | >10 |
| 精密度 | <2mP | <5% | <5-10% | <2% |
| 細胞混入に対するロバスト性 | 10 x 10 | 6 | 百万個/mL | 分析前にセルを除去 分析前にセルを除去 分析前にセルを除去 |
| オートメーション・フレンドリー | Yes | No | Yes | No |
表1. Valita®TITERの主な特徴と競合品の比較。
アッセイ原理
ValitaTiterおよびValitaTiter Plusは、蛍光標識されたプロテインG誘導体とIgG-Fc相互作用の定量を、検出用FPを用いて行う迅速ハイスループットなアッセイです。FPは分子サイズの変化を効果的に分析する（図2）。"固定 "蛍光色素は偏光によって励起され、同じ平面偏光で優先的に発光する。光子の吸収と放出の間に分子が回転すると、光の偏光が「ねじれる」。小さな分子は大きな分子よりも溶液中で速く回転する。したがって、蛍光標識Fc特異性プローブの結合に伴う分子サイズの変化は、光の偏光解消の程度を用いて検出することができる。蛍光標識されたIgG結合ペプチドが結合していない場合、IgG（～20倍大きい）に結合しているときよりも光を偏光解消し、急速に転がる。FPの検出には、溶液を平面偏光で励起し、その後、励起光に平行な面（偏光部分）と垂直な面（偏光解消部分）の両方における放出光強度を測定することが含まれる。FPは2つの強度の正規化された差として表され、通常はミリ偏光単位（mP）で表される。
材料
- ValitaCell ValitaTiter Kit (cat. #VAL003)
- ValitaCell ValitaTiter Plus キット (cat. #VAL004)
- Sigma IgG standard (Sigma cat. #I2511)
- XP Media™ CHO Growth A（Molecular Devices社、cat. #K8860）、4 mM L-グルタミン添加
- SpectraMax iD5® マルチモードマイクロプレートリーダー
- 蛍光偏光フィルター485 nm BW 25 nm垂直偏光300nm～750nm 2枚セット（Molecular Devices cat.）
- 蛍光偏光フィルター535 nm BW 25 nm垂直偏光300nm～750nm 2枚セット (Molecular Devices cat. #6590-0137)
- SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー
- 蛍光偏光（FP-FLUO）検出カートリッジ（Molecular Devices cat. #0200-7009
- SpectraMax パラダイムマルチモードマイクロプレートリーダー
- 蛍光偏光（FP-FLUO）検出カートリッジ（Molecular Devices社製 cat.）
- SpectraMax M5マルチモードマイクロプレートリーダー
図2. 蛍光偏光を利用してFc含有IgGを定量するアッセイ。結合していない小さな分子は溶液中で急速に回転し（上）、結合した大きな分子はゆっくりと回転する（下）。
方法
- XP培地/L-グルタミンを希釈液として、IgG標準物質を2.5～100mg/L（ValitaTiter）または100～2000mg/L（ValitaTiter Plus）の濃度に連続希釈した。
- 60μLの培地をValitaTiterまたはValitaTiter Plusプレートの各ウェルにプレーティングし、プローブを再構成した。
- その後、調製した標準品 60 µL を適切なウェルに添加した。
- ウェルの内容物を上下に 3 回軽くピペッティングして混合した（アッセイワークフローの概要は図 3 を参照）。
- アッセイプレートは、表2（ValitaTiter）および表3（ValitaTiter Plus）に概説されている、特定された完全に最適化された設定を用いて、Molecular Devicesマイクロプレートリーダーで測定する前に、室温で5分間（ValitaTiter）または15分間（ValitaTiter Plus）暗所でインキュベートした。
図3. アッセイプレートの各ウェルには、蛍光標識Fc特異性プローブがプレコートされている(1)。IgGサンプルはプローブに結合する(2)。結合は蛍光偏光によって測定される(3)。
| セッティング | iD5 | i3x | M5 | パラダイム |
|---|---|---|---|---|
| 測定モード | 蛍光偏光 | 蛍光偏光 | 蛍光偏光 | 蛍光偏光 |
| 励起 | 485 nmモノクロメーター | 485nm | 485 nm | 485nm |
| エミッション | 535 nmフィルター | 535nm | 525 nm,515 nm カットオフ | 535nm |
| PMTゲイン | 低い | -- | 低い | -- |
| Gファクター | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Attenuation | なし | -- | -- | -- |
| Integration time or flashes | 400 ms | 400ms | 100フラッシュ/リード | 400nm |
| 読み取り高さ (mm) | 3.6 | 4.8 | -- | 4.1 |
| セトリング時間 (ms) | -- | -- | 100 | -- |
表 2. Molecular DevicesマイクロプレートリーダーでのValita®TITERアッセイ蛍光偏光測定に最適なインストゥルメンテーション設定。SpectraMax i3xおよびParadigmリーダーにはFP-FLUO検出カートリッジが必要です。リーダーによって必要とされない設定は「---」で示されている。
| セッティング | iD5 | i3x | M5 | パラダイム |
|---|---|---|---|---|
| 測定モード | 蛍光偏光 | 蛍光偏光 | 蛍光偏光 | 蛍光偏光 |
| 励起 | 485 nmモノクロメーター | 485nm | 485 nm | 485nm |
| エミッション | 535 nmフィルター | 535nm | 525 nm,515 nm カットオフ | 535nm |
| PMTゲイン | 低い | -- | 低い | -- |
| Gファクター | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Attenuation | 1 OD | -- | -- | -- |
| Integration time or flashes | 400 ms | 400ms | 100フラッシュ/リード | 400nm |
| 読み取り高さ (mm) | 5.5 | 5.2 | -- | 4.8 |
| セトリング時間 (ms) | -- | -- | 100 | -- |
表 3. Molecular DevicesマイクロプレートリーダーでのValita®TITER Plusアッセイ蛍光偏光測定に最適なインストゥルメンテーション設定。SpectraMax i3xおよびParadigmリーダーにはFP-FLUO検出カートリッジが必要です。リーダーが必要としない設定は「---」で示す。
結果
ハイスループット創薬・開発におけるコスト効率の高いハイスループットIgG定量プラットフォームを提供するために、ValitaCellのValitaTiterアッセイをMolecular Devicesのマルチモードマイクロプレートリーダーで使用するための最適なパラメータを特定するための調査が実施された。IgG標準曲線は、サンプルやプレートの前処理や洗浄工程を必要とせず、簡単なワークフローで、シンプルな添加・読み取り法を用いて調製・分析された。
SpectraMax iD5リーダーを使用し、励起用に485 nmのFPフィルターセット、発光用に535 nmのFPフィルターセットを用いて、優れた結果が得られた。2.5mg/L～100mg/L（ValitaTiter）または100mg/L～2000mg/L（ValitaTiter Plus）のIgG標準物質は、全範囲にわたって高い直線性（R2=0.99）で検出された（図4）。SpectraMax i3x、Paradigm、およびM5リーダーで、ValitaTiter（表4）およびValitaTiter Plusアッセイ（表5）の同等のデータが得られた。SoftMax® Proソフトウェアの設定済みプロトコルにより、mP計算と曲線プロットが自動化された。
図4. ValitaTiter（A、r2 = 0.993）とValitaTiter Plus（B、r2 = 0.998）の標準曲線。曲線はSoftMax® Proソフトウェアの線形カーブフィットを用いてプロットした。
| iD5 | i3x | M5 | パラダイム | |
|---|---|---|---|---|
| デルタ mP | 93 | 70 | 80 | 89 |
| 平均StDev (mP) | 1.12 | 2.12 | 0.57 | 0.82 |
| 平均%CV | 0.7 | 0.7 | 0.5 | 0.3 |
| 最大StDev | 1.54 | 3.53 | 1.06 | 1.27 |
| 最大%CV | 1.0 | 1.3 | 1.0 | 0.4 |
表4. Molecular Devices社製リーダーで読み取ったValita®TITER標準物質の標準Delta mP、平均標準偏差（StDev）および%CV（n = 4）。
| iD5 | i3x | M5 | パラダイム | |
|---|---|---|---|---|
| デルタ mP | 69 | 85 | 92 | 88 |
| 平均StDev (mP) | 1.05 | 3.54 | 1.63 | 1.14 |
| 平均%CV | 0.7 | 1.3 | 1.6 | 0.4 |
| 最大StDev | 1.59 | 6.49 | 2.26 | 1.43 |
| 最大%CV | 1.1 | 2.0 | 2.4 | 0.5 |
表5. Molecular Devices社製リーダーで読み取ったValita®TITER Plus標準物質の標準Delta mP、平均標準偏差（StDev）、%CV（n = 4）。
結論
mAb IgG力価の正確で信頼性の高い測定は、すべての生物製剤の製造において最適なセル培養性能を確保するために、開発およびその後の製造において不可欠である。最小限の時間とリソースで正確な結果が得られるアッセイは、成功に不可欠である。ここでは、ValitaTiterアッセイとMolecular Devicesマイクロプレートリーダーを組み合わせることで、幅広い機能範囲にわたってIgGの定量が可能であることを実証する。
ValitaTiterアッセイは、サンプルの前処理や精製工程を必要とせず、粗サンプル中のIgGを正確かつ迅速に定量するホモジニアスなハイスループット法です。この96ウェルアッセイは、SpectraMax iD5リーダーおよびFP検出機能を備えた他のMolecular Devicesマイクロプレートリーダーで完全に検証されており、信頼性の高い結果が得られます。SoftMax Proソフトウェアは、検出のためのセットアップ時間を最小限に抑え、標準カーブフィット処理とサンプルの定量を自動化します。
PDF版（英語）