Application Note ヒト疾患のモデル生物であるゼブラフィッシュを用いた
ハイスループット・イメージング・アッセイ

全生物の複雑な3次元的コンテクストにおいて、数日で数千の化合物を評価する
広範な疾患および毒性モデルのスクリーニング
1枚の画像で全身の表現型を可視化・測定
自動化された高速Z-スタック画像取得により、頭部から尾部までピントが合った画像を維持

PDF版（英語）

なぜゼブラフィッシュのスクリーニングなのか？

近年、ゼブラフィッシュを用いたスクリーニングは、コスト、スループット、倫理的懸念の軽減などの理由から、哺乳類スクリーニングの代替法として支持されている。ゼブラフィッシュはヒトと生物学的に類似性が高いため、医薬品開発に有用なモデルである。個体発生や器官形成の研究から、ゼブラフィッシュの主要な器官系はヒトと非常によく似ていることが示されており、ゼブラフィッシュとホモ・サピエンスの間のシンテニーは70〜80％と高い。

ゼブラフィッシュは繁殖力が強く、胚が透明で器官構造を見ることができ、遺伝子操作が容易であるため、スクリーニングアッセイに有益である。サイズが小さいので、胚をマイクロタイタープレートに入れ、化合物で処理することができる。その後、高含量スクリーニングシステムで表現型を測定することができる。

ImageXpress®ハイコンテンツスクリーニングシステムは、広い視野で高画質な画像を取得するための最適な柔軟性を提供します。MetaXpress®ハイコンテンツ画像取得・解析ソフトウェアは、シンプルなワークフローで幅広いアプリケーションの画像解析を可能にし、データマイニング用のAcuityXpressハイコンテンツインフォマティクスソフトウェアと組み合わせることで、このエンドツーエンドのソリューションは、ゼブラフィッシュベースのin vivoスクリーニングのスループットを劇的に向上させます。

ゼブラフィッシュを用いたin vivo高含有量スクリーニングアプリケーション

ゼブラフィッシュで開発されたヒト疾患モデルは数多くある：

メタボリックシンドローム：肥満（内臓脂肪）、脂質異常症、脂肪肝、耐糖能障害
ヒト癌細胞の異種移植：腫瘍血管新生、遠隔転移
循環器系疾患：心不全、薬剤性不整脈
中枢神経系疾患：難聴、視覚障害、嗅覚障害、てんかん、発達障害、睡眠覚醒障害、筋ジストロフィー（ALS）

これらの疾患の研究にハイコンテントイメージングアッセイがどのように利用できるか、いくつかの例をここに示す。

本アプリケーションノートに掲載されたデータは、三重大学大学院医学系研究科ファーマコゲノミクス講座の田中俊夫教授より提供されたものです。

ヒトがん細胞の異種移植後の腫瘍転移のモデル化1

図1 （A）ヒトがん細胞をゼブラフィッシュに移植するワークフロー。(B）クサビラオレンジ（赤）で標識したヒト白血病幹細胞をゼブラフィッシュ胚（緑）に移植した画像。(C）腫瘍の大きさと転移を測定し、異なる化合物による様々な阻害レベルをグラフ化したもの。

血管新生阻害のモニタリング

図2. 血管内皮細胞にGFPを発現させたゼブラフィッシュを12～48時間化合物に曝露した。セグメント間血管、主幹から出現する細い背側血管と腹側血管は、MetaXpressソフトウェアの血管新生管形成アプリケーションモジュールを用いて測定した。化合物処理によって血管新生血管の成長が阻害されることが明らかである。

心機能分析

図3. 心臓にGFPタグ付きタンパク質を発現する細胞を持つトランスジェニックゼブラフィッシュの心臓機能は、心臓を関心領域として輪郭を描き、タイムラプスイメージングを用いて心臓の拍動に伴う面積または強度の経時変化を測定することで測定される。MetaXpressは時間経過に伴う強度の変動を表示する。

遺伝子ノックダウン定量2

図4. リッサミン蛍光を用いて、注入したモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（MO）の量と遺伝子ノックダウンのレベルを相関させた。

耳毒性の測定

図5. ゼブラフィッシュの有毛細胞の破壊は、耳毒性の指標として用いられてきた。耳毒性を引き起こすことが知られている毒性化合物でゼブラフィッシュを処理した後、蛍光標識した有毛細胞をスポットカウントアルゴリズムを用いて測定した。

神経毒性の特定

図6. 蛍光標識した神経細胞（画像では黄色）を持つゼブラフィッシュを神経毒性化合物で処理し、神経毒性の指標として、曝露によって影響を受けた脳の面積を測定した。高用量の化合物を投与した場合、測定された蛍光脳面積は未処理の対照胚に比べて有意に小さかった。

ウェルまたはゼブラフィッシュの特定領域のターゲット画像取得

すべてのウェルで同じ領域に存在しない可能性のある対象物に対しては、低倍率で対象物を特定し、その座標に戻ってより高倍率の画像を取得するために、ターゲットイメージングを使用することができる。

図7. 魚全体を1視野で撮影。(A）完全にピントの合った画像を得るために、複数のZ平面を取得し、ベストフォーカスアルゴリズムを用いて合成した。(B）その後、関心領域（オレンジ色の輪郭）を高倍率で再取得。(C）デジタルコンフォーカル機能は、解像度を向上させ、細胞内の特徴をより正確にセグメンテーションするために使用できるオンザフライデコンボリューション法である。

概要

ゼブラフィッシュ胚は、トランスレーショナルリサーチのための貴重な脊椎動物モデルです。ImageXpressハイコンテントスクリーニングシステムを使用して、ゼブラフィッシュの頭部から尾部までの焦点の合った画像を大視野と高速Zスタッキングで取得することにより、疾患や毒性に特徴的な表現型を測定する能力を提供します。ゼブラフィッシュのハイスループットin vivoイメージングとMetaXpressハイコンテンツ解析ソフトウェアの組み合わせは、研究室のスループットを劇的に向上させ、わずか数日で数千の化合物をスクリーニングすることを可能にします。このエンドツーエンドのソリューションにより、血管新生の阻害をモニターし、遺伝子ノックダウンを定量化し、耳毒性と神経毒性を測定するために、自動化されたイメージングスクリーンをセットアップして実行することができます。

参考文献

Zhang, B., et al., Quantitative phenotyping-based in vivo chemical screening in a zebrafish model of leukemia stem cell xenotransplantation, PLoS One, 2014 Jan 15; 9(1).
ゼブラフィッシュの遺伝子ノックダウンと心臓機能イメージングのための蛍光ベースの方法、Mol Biotechnol、2013 Oct; 55(2)： 131-42.
Kanungo, J., et al., In vivo imaging and quantitative analysis of changes in axon length using transgenic zebrafish embryos. Neurotoxicol Teratol, 2011 Nov-Dec; 33(6)： 618-23.
Diekmann, H., et al., Characterization of optic nerve regeneration using transgenic zebrafish. Front Cell Neurosci, 2015 April 9; 9:118.
Huan, H., et al., High-throughput screening for bioactive molecules using primary cell culture of transgenic zebrafish embryos. Cell Rep, 2012 Sep 27; 2(3):695-704.

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