Application Note AbraxisメラミンELISAキットによるハイスループットなメラミン検出

はじめに

有機塩基であるメラミンは、プラスチック、難燃剤、顔料、肥料など、多くの製品の製造に使用されている。最近、見かけのタンパク質含有量を増やすために、メラミンを家畜飼料や食用食品に添加する行為が報告されている。メラミンは重篤な疾病や死亡の原因となる可能性があるため、様々な食品中のメラミン汚染を検出する方法の特定に関心が高まっている1。

Abraxisメラミン酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）は、メラミンを定量的にスクリーニングするためのイムノアッセイである2。既知のメラミン濃度を持つキャリブレーション、サンプル抽出物、およびメラミンホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）結合体を、メラミン抗体でコートされた試験ウェルに添加します。検体のメラミンとメラミンHRP結合体はメラミン抗体との結合で競合し、その後の洗浄で結合していないメラミンとHRP結合体が除去されます。その後、基質をウェルに添加し、結合した酵素コンジュゲートの量に比例してウェルが発色します。インキュベート後、反応を停止し、吸光マイクロプレートリーダーでウェルの吸光度を読み取る。検体のメラミン濃度はキャリブレーターの標準曲線から補間される。

メラミン ELISA の検出には、Molecular Devices 社の吸光マイクロプレートリーダーが使用されます。データ収集と分析は、FDA 21 CFR Part 11準拠の業界標準分析ソフトウェアであるSoftMax® Pro GxPソフトウェアを使用して実行されます。SoftMax Pro ソフトウェアには、Abraxis メラミン ELISA キットのデータ収集と解析を簡素化するための設定済みプロトコルが用意されています。

材料

• 吸光度検出モード付きMolecular Devicesマイクロプレートリーダー：
  ◦SpectraMax ® Plus 384 (cat. #PLUS 384)
  ◦SpectraMax 190 (cat. #190)
  ◦SpectraMax 340PC384 (cat. #340PC 384)
  ◦VersaMax™ (製品番号 VERSAMAX)
  ◦SpectraMax M2/M2e (型番: M2 または M2E)
  ◦SpectraMax M5/M5e (型番: M5 または M5E)
  ◦FlexStation ® 3 (型番: FLEX3)
  ◦SpectraMax i3x (型番: i3x)
  ◦SpectraMax iD3 (cat. #iD3)
• メラミンELISAキット (Abraxis Cat. #50005B)

マルチチャンネルピペッターを用い、各ウェルに100µLのStop Solutionを添加した。

SoftMax Proソフトウェアで事前に設定したプロトコルを用いて、VersaMaxマイクロプレートリーダーでウェルの吸光度を450nmで読み取った。

キャリブレーションはSoftMax Proソフトウェアの4パラメータカーブフィットを用いてプロットした。

方法

アッセイを実施する前に、試薬を室温に平衡化した。5x Wash Buffer濃縮液を脱イオン水で1:5に希釈し、洗浄液とした。

テストウェルをマイクロウェルホルダーにセットした。未使用のウェルは、乾燥剤を入れたビニール袋に密封しました。

分注ごとに新しいピペットチップを使用して、100 µLのキャリブレーションをテストウェルに加えました。10億分の1(ppb)までの検出を実証するため、20ppbのキャリブレーターを1:2に希釈したキャリブレーター希釈液を用意しました。50 µL のメラミン HRP コンジュゲートを各ウェルに添加しました。

プレートを60秒間静かに回転させ、室温で30分間インキュベートした。

ウェルの内容物を吸引し、ウェルを400μLの洗浄液で合計4回洗浄した。

最後の洗浄の後、プレートを吸光度紙の上に倒立させ、最後の洗浄液を除去した。

マルチチャンネルピペッターを用いて、各ウェルに基質（発色液）100 µLを加えた。

プレートを室温で20分間インキュベートした。

結果

キャリブレーターは、SoftMax Proソフトウェアの4パラメータカーブフィットを使用してプロットした。logit/logカーブフィットも使用できるが、4パラメータが望ましい。B は各標準物質の平均吸光度値で、B0 はゼロ標準物質の平均吸光度です。試料の%B/B0は、標準曲線からの内挿法でppb単位のメラミン濃度になります。このアッセイでは、50％B/B0は193ppbと計算され、メラミンELISAキットの製品添付文書に示された値の範囲と一致しました。

10ppbまでのアッセイ感度を実証するために、20ppbの標準物質を1:2に希釈して、追加の標準物質を調製した。得られた平均光学濃度（OD）対濃度のグラフを図2に示す。メラミン ELISA キットの測定感度は 10 ppb です。

10ppbまでのアッセイ感度を実証するために、20ppbの標準物質を1:2に希釈して、追加の標準物質を調製した。得られた平均光学濃度（OD）対濃度のグラフを図2に示す。メラミン ELISA キットの測定感度は 10 ppb です。

VersaMaxリーダーを用いると、少なくとも10 ppb程度の低濃度のメラミンを確実に検出できる。EMaxマイクロプレートリーダーでも同様の結果が得られる（データは示さず）。

メラミンELISAキットの製品添付文書に記載されている試験再現性の性能データによると、標準物質の分散係数（CV）は10%未満である。このアプリケーションノートでは、すべての標準物質のCVが5%未満であることを実証しています。(表1参照）。

表1. メラミン標準物質。平均、標準偏差、CV、%B/B0はSoftMax® Proソフトウェアで算出。CVの範囲は0.8～4.9で、Abraxisが示した標準物質の試験再現性の限界である10%を大きく下回っている。

結論

メラミン ELISA の検査感度は 10 ppb（µg/L）である。我々は、VersaMaxマイクロプレートリーダーが少なくとも10 ppbのメラミンまで検出できることを実証しました。判定が最も正確な結果をもたらす試験の中間値（50% B/B0）は193 ppbである。これはAbraxis社が発表した値と一致している。CVはすべての標準物質で5％未満であり、メラミンELISA製品の添付文書に記載されている10％未満という試験再現性のガイドラインをはるかに下回ることが示された。

Abraxis社のメラミンELISAキットは、Molecular Devices社のSpectraMax、VersaMax、VMax、EMaxマイクロプレートリーダーとともに、牛乳、乳児用粉ミルク、ペットフード、菓子などの食品中のメラミン汚染を検出するための品質保証スクリーニングソリューションを提供します。Molecular Devices 社は、Applied Biosystems 社との合弁パートナーシップを通じて、食品安全性検査用の質量分析ベースのソリューションも提供しています。完全なデータ解析は、FDA 21 CFR Part 11 準拠の業界標準解析ソフトウェアである SoftMax Pro GxP ソフトウェアによって提供されます。

スループットを向上させるために、SpectraMaxマイクロプレートリーダーはMolecular Devices StakMax® マイクロプレート処理システムと統合することができます。また、StakMaxシステムをMolecular Devices AquaMax® 4000マイクロプレートウォッシャーと組み合わせることもできます。これらの組み合わせは、手作業によるプレートハンドリングを最小限に抑えながら、スループットを最大化します。

参考文献

1. Garber, E. A. (2008) 市販の酵素結合免疫吸着測定法を用いたメラミンの検出。J. Food Protection 71(3)： 590-594.
   
   
2. Abraxis メラミンプレートキット（Cat. #50005B）の取扱説明書。

吸光度リーダーについてさらに詳しく >>