Application Note Beacon Analytical Systemsメラミンプレートキットによる
ハイスループットなメラミン検出

はじめに

有機塩基であるメラミンは、プラスチック、難燃剤、顔料、肥料など、多くの製品の製造に使用されている。最近、見かけのタンパク質含有量を増やすために、メラミンを家畜飼料や食用食品に添加する行為が報告されている。メラミン汚染は動物や人間に重篤な病気や死を引き起こす可能性があるため、様々な食品中のメラミン汚染を検出する方法の特定に関心が高まっている。このアプリケーションノートでは、Beacon Analytical Systems社のメラミンプレートキットの紹介とバリデーションを行います。

Beacon Melamine Plate Kitは、汚染サンプル中のメラミンを定量分析するための競合型酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）です。このキットを使用して、乳製品、小麦グルテン、ウェットおよびドライペットフードなど、さまざまな種類のサンプルを測定できます。メラミンは、抽出液と混合または振とうすることで検体から抽出されます。メラミンHRPコンジュゲート、検体抽出液、キャリブレーターを、メラミン抗体でコートした検査ウエルにピペッティングします。30分間のインキュベーション後、ウェルを洗浄して未結合のメラミンを除去し、基質をウェルに添加する。30分後に反応を停止し、吸光マイクロプレートリーダーを用いてウェルの吸光度を測定する。試験サンプルのメラミン濃度は、メラミン標準曲線から補間される。

Molecular Devices社の吸光マイクロプレートリーダーは、メラミンアッセイの吸光度を検出するために使用されます。Molecular Devices社のAquaMax® 4000マイクロプレートウォッシャーが、すべてのマイクロプレートウェルを同時に吸引・分注し、必要な洗浄ステップを迅速に完了します。データ収集と解析は、FDA 21 CFR Part 11準拠の業界標準解析ソフトウェアであるSoftMax® Pro GxPソフトウェアであらかじめ設定されたメラミンELISAプロトコルを使用して実行されます。

材料

●吸光度検出モード付きMolecular Devicesマイクロプレートリーダー：
　〇SpectraMax ® Plus 384 (cat. #PLUS 384)
　〇SpectraMax 190 (cat. #190)
　〇SpectraMax 340PC384 (cat. #340PC 384)
　〇VersaMax™ (製品番号 VERSAMAX)
　〇SpectraMax M2/M2 e (カタログ番号 M2 または M2E)
　〇SpectraMax M5/M5 e (型番: M5 または M5E)
　〇FlexStation ® 3 (型番: FLEX3)
　〇SpectraMax i3x (型番: i3x)
　〇SpectraMax iD3 (商品番号iD3)
●Molecular Devices AquaMax 4000 マイクロプレートウォッシャー（注文に応じて構成します。）
●メラミンプレートキット (Beacon Analytical Systems, cat. #20-0158)

試験方法

• 試験を実施する前に、試薬を室温に戻した。
• メラミン抗体を塗布した適切な数のウェルをマイクロウェルホルダーにセットした。残りのテストウェルは、付属のジッパー付きバッグに再密封した。96ウェルすべてを一度に洗浄するマイクロプレートウォッシャーAquaMax 4000を使用することができます。
• 150µLのキャリブレーション（トリプリケート）または希釈サンプル抽出液を、使い捨てチップ付きピペットを用いて適切な試験ウェルに添加した。それぞれ清潔なピペットチップを使用した。
• 各ウェルにメラミン HRP 抱合体を 50μL 添加した。
• プレートを60秒間軽く振り、室温で30分間インキュベートした。
• ウェルの内容物を吸引し、250µLの洗浄液（1x PBS/0.05% Tween-20）をAquaMax 4000マイクロプレートウォッシャーを用いて分注し、合計4回の吸引/分注サイクルを行った。
• 最後の洗浄後、反転したプレートを吸光度ソリューションの上にタッピングし、残存する洗浄液を除去した。
• 100μLの基質を各ウェルに分注し、プレートを室温で30分間インキュベートした。
• 100μLの停止液を各試験ウェルに分注した。
• SoftMax Proソフトウェアの設定済みプロトコルを使用して、VersaMaxマイクロプレートリーダーで450nmの吸光度を測定した。
• キャリブレーションはSoftMax Proソフトウェアを用いてプロットした。

結果

光学濃度（OD）値を用いて標準曲線を作成した。キャリブレーターのOD値（y軸）とキャリブレーター濃度の対数（x軸）をプロットした。検体のメラミン含有量は、標準曲線から補間することができた。OD値が最低検量線より大きい試料または最高検量線より小さい試料は、それぞれ<20 ppbまたは>500 ppbとして報告しなければならない。

図1は、上記のようにプロットしたメラミン標準曲線を4パラメータカーブフィット処理で示したものです。図2は、半log-logカーブフィットを用いてプロットしたメラミン標準物質を示しています。通常、4パラメータカーブフィットの方が、標準曲 線の高値側と低値側でよりよくフィットし、好ましい。

表1にメラミンプレート・キットのキャリブレーター・データの要約を示します。製品添付文書に概説されている試験手順と、必要な洗浄ステップにAquaMax® 4000マイクロプレートウォッシャーを使用した場合、5%未満の優れたCVが観察されました。

表1. メラミンプレート・キットのデータ概要。平均OD、標準偏差、%CVはSoftMax® Proソフトウェアで算出。標準品はトリプリケートで実施した。

結論

Beacon Analytical Systemsのメラミンプレートキットは、Molecular DevicesのSpectraMax、VersaMax、VMax、EMaxマイクロプレートリーダーとともに、牛乳、粉ミルク、ヨーグルト、小麦グルテン、湿潤および乾燥ペットフードなどの食品中のメラミン汚染を検出するための品質保証スクリーニングソリューションを提供します。Molecular Devices社のAquaMax 4000マイクロプレートウォッシャーは、ELISA洗浄ステップの自動化により優れた再現性を実現し、StakMax®マイクロプレートハンドリングシステムと統合してスループットを向上させることができます。また、StakMaxシステムをSpectraMaxおよびVersaMaxマイクロプレートリーダーと組み合わせることで、手作業によるプレートハンドリングを最小限に抑えることができます。完全なデータ解析は、FDA 21 CFR Part 11準拠の業界標準解析ソフトウェアであるSoftMax Pro GxPソフトウェアによって提供されます。

参考文献

1. メラミンプレートキット取扱説明書（Beacon Analytical Systems)

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