Application Note バイオ燃料用高脂質生産者のハイスループットスクリーニングと選択

はじめに

近年、代替・再生可能エネルギー生産製品への関心が著しく高まっている。最も著名な代替エネルギー資源のひとつが、トリアシルグリセロール（TAG）を主成分とするエネルギー豊富な携帯燃料であるバイオディーゼルである。農作物の種子から生産されるバイオ燃料は、食品と燃料の競合のため、最近大きな注目を集めている。脂質生産微生物系からのバイオディーゼル生産は、持続可能で高品質な燃料を生成するために、かなり注目されている。貯蔵されたTAGを大量に蓄積することができる油脂性微生物（バクテリア、藻類、真菌類）は、脂質ベースのバイオ燃料生産の前駆体として利用されている。合成生物学と代謝工学のアプローチを用いて、研究者たちはこれらの微生物を操作し、環境と市場の両方の要求を満たすことを目的とした次世代バイオ燃料と再生可能エネルギー製品を生産している。

バイオ燃料生産における主要なボトルネックの一つは、一次スクリーニングにおける最終産物の客観的で機能的な読み出しによって可能となる、価値の高いヒットをより早く確実に同定することである。不可欠ではあるが、手作業によるコロニーピッキング、それに続くビシンコニン酸アッセイ、光学密度測定、ガスクロマトグラフィーアッセイは、時間がかかり、エラーを起こしやすい作業である。生産性を高め、適切な候補を見つけるまでの期間を短縮するためには、自動化された客観的なコロニー選択が必要である。ここでは、QPix™ 400シリーズが、蛍光色素を用いた脂質産生の定量的測定に基づき、生産性が高く、信頼性の高い方法で目的の脂質分泌コロニーを選択する方法について説明します。

脂質蓄積細菌の培養

Rhodococcus opacus PD630は、基質耐性が高く、増殖が速く、高密度培養が可能であることから、モデル生物として選択された。R.opacus株（DSM 44193）はDSMZ culture collectionから入手し、Trypticase Soy Broth（TSB）培地で28℃で培養した。非脂質蓄積性の陰性対照菌として、ATCC（Migula 47076）のEscherichia coli株を37℃のTSB培地で培養した。両菌の液体培養を、振盪培養器内で1～3日間好気的に増殖させた。その後、Trypticase soy agar（TSA）培地と0.5 µg/mLのナイルレッド（AAT Bioquest, Inc.）を含む固体寒天プレート上で、28℃で48～72時間培養した。

白色光と蛍光イメージングを用いた客観的コロニースクリーニング

親油性蛍光色素であるナイルレッドは、培養寒天プレート上で増殖する細菌のコロニーから直接脂質産生を検出し、高脂質蓄積性のR.opacus株と非蓄積性の陰性対照大腸菌を区別します。コロニーのある培養プレートをQPix™ 420システムで白色光とFITCフィルターセット（Ex 457nm/ Em 536nm）を用いた蛍光で画像化した（図1）。高脂質蓄積性R.opacus株を含むコロニーは、QPix 420システムのUV蛍光チャンネルで強い蛍光を示したが、陰性対照コロニーは顕著な蛍光を示さなかった（図2）。QPixシステムの白色光と蛍光イメージングの両方を用いたコロニー検出により、脂質蓄積に基づく蛍光を示すコロニーの客観的な同定と選択が可能になる。

調整可能なソフトウェア・パラメーターを用いたコロニー選択の最適化

QPixシステムの完全空圧式96ピンピッキングヘッドを用いて、脂質蓄積量が多いことを示す蛍光コロニーと蓄積していないことを示す非蛍光コロニーをそれぞれピッキングした。脂質蓄積レベルはピッキング後にさらに確認した。液体培地で一晩培養した後、親油性の明緑色蛍光色素BODIPY 505/515（Life Technologies社製）を0.5 µg/mLの濃度で用いて培養液を染色し、SpectraMax® M5 MultiMode Microplate Readerで蛍光測定を記録した。QPix 420システムを用いて最初に選択・摘出した高脂質蓄積性コロニーでは高度の蛍光が確認されたが、陰性対照の大腸菌コロニーでは赤色で描かれるようにバックグラウンドレベルの蛍光が示された（図4A）。さらに、BODIPY 505/515 で染色した高脂質産生 R.opacus の画像を、ImageXpress® Micro XLS Widefield High Content Screening System を用いて 40 倍の倍率で取得した（図 4B）。親油性色素による明るい緑色の蛍光染色は、R.opacusにおける高脂質蓄積を示す。

図4 （A）親油性蛍光色素BODIPY 505/515で染色した高脂質産生コロニーと陰性対照群のSpectraMax M5マルチモードマイクロプレートリーダーでの蛍光測定。高脂質産生コロニーは高い蛍光（RFU）値を示し、対照的に陰性コロニーは赤色で描かれたように平坦なラインのシグナルを示した。 (B) 高脂質産生R.opacusの蛍光画像は、ImageXpress Micro XLS Widefield High Content Screening Systemを用いて40倍の倍率で取得した、親油性BODIPY 505/515色素による明るい緑色の染色を示した。

これらのデータは、高脂質産生コロニーが示す蛍光に基づき、コロニーを区別して選択・採取する能力を実証している。ライブラリースクリーニングなどの用途で大量のコロニーを検査できるため、価値の高い菌株と価値の低い菌株を効率的かつ確実に同定できる。さらに、QPix 400シリーズが提供する定量蛍光イメージングと客観的なソフトウェア解析により、二次スクリーニングアッセイをワークフローから排除できる可能性がある。これにより、価値の高いコロニーを単離するためのワークフロー効率を向上させながら、サンプル処理時間を短縮し、コストを削減することができる。

概要

自動微生物コロニーピッカーのQPix 400シリーズは、従来の手作業によるピッキングアプローチに代わる、高い生産性と信頼性を提供します。QPix 400シリーズを実験ワークフローに導入することで、目的のコロニーを得るための全体的な処理時間を短縮することができます。QPix 400シリーズの蛍光検出機能により、高脂質産生細菌のコロニーを正確に検出し、選択することができます。柔軟で使いやすいソフトウェアにより、ユーザーは自動ピッキング実験に最適なコロニー選択基準をカスタマイズして定義することができる。この研究では、代謝工学やバイオ燃料生産のためのタンパク質進化の研究において、価値の高いコロニーを分離するための時間節約アプローチについて説明する。

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