Application Note 抗体探索のための均一性ハイスループット細胞表面結合アッセイ

はじめに

ハイブリドーマ上清の細胞表面抗原に対する抗体探索は、治療用抗体の探索および開発において重要である。ここでは、ホモジニアスアッセイフォーマットを用いたImageXpress® Velosシステムを用いた、抗体探索および一次スクリーニングにおける細胞表面結合抗体の定量について報告する。特許取得済みの光学系により、細胞表面結合蛍光を非常に高感度に、優れたバックグラウンド除去で検出することができる。システムはウェル全体にわたってデータを取得し、384ウェルプレートを5分未満でスキャンできる。蛍光バックグラウンドが存在しても、データの取得と解析が可能であるため、標的特異的ヒト抗体を検出するための真の均一性細胞表面結合アッセイを行うことができる。さらに、488nmの青色レーザーと640nmの赤色レーザーを用いて、同じアッセイと適切な蛍光標識二次抗体を比較した。

アッセイ手順

ホモジニアス細胞表面結合アッセイ。384ウェル均一性細胞表面結合アッセイのフロー図を図1に示す。標的特異性ヒトIgG、親細胞および標的発現CHO-S細胞は、Medarex社（Milpitas, CA）から提供された。細胞は-80℃で保存された凍結アリコート（10 x 10⁶ cells/mL）として提供された。細胞バイアルを解凍し、細胞を直ちに5% FBSを封じ込めた5 mLのPBSに希釈した。室温で10分間インキュベートした後、細胞を800 x gで2分間遠心した。上清を捨て、細胞ペレットを5mLの細胞解離バッファー（酵素不含、Invitrogen、Cat # 13151-014）に懸濁し、細胞計数のために一部を取り除いた。細胞は細胞解離バッファーで4 x 10⁵ cells/mLに調整した。標的特異性ヒトIgG抗体の希釈系列を、5%FBSを封じ込めたPBS中の10μg/mlストック溶液から調製した。384ウェル黒壁プレート（medium bind surface, Greiner Bio-One, Cat # 781096）に標的特異性抗体の希釈系列を20μL/ウェル添加し、細胞結合アッセイを組み立てた。次に、親細胞またはトランスフェクトCHO細胞に加えて、Alexa-Fluor 488（AF488コンジュゲート抗ヒトIgG、H+L鎖特異性、Invitrogen社、Cat # A-11013）またはCy5（Cy5コンジュゲート抗ヒトIgG、Fc_γフラグメント特異性、Jackson Immunoresearch Laboratories社、Cat # 109-175-098）で標識した抗ヒトIgGを添加した（40μL/ウェル）。8000細胞/ウェルの細胞結合反応を、光照射からプレートを保護しながら室温でインキュベートした。

細胞への抗体結合の検出。このデモに使用したImageXpress VelosシステムDLレーザースキャニングプラットフォームは、20mWの488nmレーザーと50mWの640nmレーザーの2つの励起光源で構成されていた。488nmレーザーは、510-540nm（緑）バンドパスフィルターと560nm LPダイクロイックフィルターを備えたチャンネル1と2（Ch1とCh2）を使用して、AF488検出に使用された。660-680nm（赤）のバンドパスフィルターを使用したチャンネル3と4（Ch3とCh4）を用いて、Cy5の検出に640nmのレーザーを使用した。画像取得は5×5ミクロンサンプリングで行い、384ウェルプレート全体をスキャンした。2つのチャンネルの画像は、後述するように処理する前に平均化された。この条件下でのスキャンと解析の合計時間は5分未満である。

結果と考察

ホモジニアス細胞結合アッセイ

ホモジニアスアッセイフォーマットで高感度検出を提供するImageXpress Velosシステム光学セットアップの概略図を図2に示す。励起レーザーと捕集光路の交差は、蛍光の捕集をウェルの底部付近に制限する限定された検出領域を形成する。これによりバックグラウンド蛍光が減少し、細胞結合蛍光シグナルの測定が改善される。

対称的な2つのコレクションヘッドは、両眼検出セットアップを提供し、収集されるシグナル量を2倍にします。これにより、測定のS/Nが向上し、ウェルシャドーイングの影響を低減することで、アッセイが改善されます。

画像処理と解析

各ウェルの画像を処理し、細胞蛍光強度の合計（積算）を求めた。画像に関心領域（ROI）を設定し、画像平坦化アルゴリズ ムを適用し、ROI内のバックグラウンド強度レベルに基づいて閾値を 自動的に決定した。閾値以上のすべてのピクセルのグレースケール値が合計され、バックグラウンドが補正された。この値は画像取得後、統合された画像解析プログラムによって自動的に生成された。プレートの結果はウェルごとにテキストファイルで報告され、さらなる解析とデータプレーティングのためにBBIが開発したマクロを用いてExcel（Microsoft）にインポートされた。488nmと640nmの両レーザーで撮影した代表的な画像を図3に示す。

様々なインキュベーション時間における一次抗体濃度の関数として測定した総蛍光応答も図3に示す。AF488とCy5の両アッセイで、蛍光強度の時間および抗体濃度依存性の増加が観察された。ホモジニアス結合アッセイで一般的に観察されるように、一次抗体濃度が高いと、セルに関連する蛍光強度は減少する。これは、細胞結合部位が飽和し、それに対応して溶液中の一次抗体濃度が高くなるためである。二次抗体濃度が制限されている場合（これらの研究で はそうである）、一次抗体濃度が高くなるにつれて、溶液中の 一次抗体と結合する割合が多くなり、細胞の蛍光は減少する。

AF488アッセイ系とCy5アッセイ系では、結合のカイネティクスに違いが見られた。例えば、インキュベーション時間30分における有意な蛍光強度は、Cy5を用いたアッセイでのみ観察された。AF488アッセイのシグナルは60分まで観察されなかった。一晩のインキュベーション（16時間）の後、AF488アッセイとCy5アッセイの両方が、同程度の総強度で優れたシグナルを示した。しかし、AF488アッセイは一次濃度が低いと飽和し、プラトー領域が広がった。

結論

ImageXpressベロスシステムは、探索およびプライマリースクリーニングアプリケーションにおいて、細胞表面結合抗体を定量するためのシンプル、高速、ハイスループットのホモジニアスアッセイフォーマットを可能にする。本レポートで示したように、蛍光イメージバッ クグラウンドの存在下でも画像取得と解析が可能であり、標的特異性ヒト抗体検出のための真のホモジニアス細胞表面結合アッセイを可能にする。さらに、同じアッセイと適切な蛍光標識二次抗体を用いて、488nm青色レーザーと640nm赤色レーザーの使用を比較した。その結果、60分、90分、16時間のインキュベーション後、蛍光強度が抗体濃度依存的に増加する同様のパターンが示された。このアッセイフォーマットは、リキッドハンドリングステップが2つしかなく、1536ウェルプレートでの使用が可能であることを示唆する性能を備えている。このプラットフォームのユニークな光学系とスキャニング・エンジンにより、シンプルな "プラグ・アンド・プレイ "アプリケーションが可能になり、学界と産業界の両方のライフサイエンス研究者のニーズに応えることができる。また、アッセイのロスト性と読み取り時間の速さから、抗体治療薬の開発・製造におけるバイオプロセス管理にも最適です。

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