Application Note プロテインAコンタミナントアッセイ

はじめに

黄色ブドウ球菌の細胞壁から精製されたプロテインAは、42,000ダルトンのタンパク質である。抗体のFc領域に対して4つの結合部位を持ち、そのうちの2つの部位のみが同時に占有される可能性がある。このFc領域への結合能力は、抗体の精製に利用されている1。共有結合したプロテインAを封じ込めたクロマトグラフィー用培地やメンブレンは、溶液から抗体を捕捉し、他の成分はカラムやメンブレンを通過する。結合した抗体はpHを下げることで溶出される。このようにして精製され、医薬品として使用される抗体は、これらの培地から溶出した可能性のあるプロテインAについて検査されなければならない。

このアプリケーションノートでは、市販の抗 Protein A 抗体を用いた Protein A 汚染アッセイの予備的な性能について説明します。Protein AはそのFc領域に結合しないため、チキン抗体が選択されました1。本書はガイドとして作成されたものであり、本アッセイのバリデーションを示すものではなく、また必ずしも最適な性能パラメータを示すものでもありません。

材料

Protein A の組換え体を以下のデータの標準として使用した。すべてのサンプル、標準品、標識抗体は ILA Assay Buffer で希釈した。

1. Molecular Devices Corporation（カタログ番号 0200-0500）の Threshold® System****（1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089, tel: 408-747-1700 または 800-635-5577）。
2. Molecular Devices CorporationのImmuno-Ligand Assay Labeling Kit****（カタログ番号R9002）。
3. Molecular Devices CorporationのImmuno-Ligand Assay Detection Kit****（カタログ番号R9003）。
4. Recombinant Protein A**** from CalBiochem (catalog #539203), San Diego, CA, tel: 800-854-3417 or 619-450-9600.
5. ポリクローナルニワトリ抗プロテインA抗体****（精製プロテインAに対して上昇させ、免疫アフィニティー精製したもの）は、OEM Concepts, Toms River, New Jersey, tel: 908-341-3570より購入した。
6. Sephadex® G-25カラム****はPharmacia Biotech社から購入した（PD-10、カタログ番号17-0851-01）。
7. サンプル抗体****（HuIgG、MuIgG 1、MuIgG 2a、MuIgG 2b ）は、Molecular Devices Corporationの顧客のご好意により提供された。

方法

抗体の標識

ニワトリ抗タンパク質 A 抗体は、Threshold System Operator's Manual の ILA セクションおよび ILA アプリケーションノート Optimizing the labeling of proteins に記載されている方法で標識した。ニワトリ抗タンパク質 A 抗体は、標識の前にアジ化ナトリウムを除去するため、PBS に対して 4℃で一晩透析した。抗体のアリコートを、ビオチン-DNP-NHS またはフルオレセイン-NHS と 20:1 のモルカップリング比（MCR）で、暗所、室温で 2 時間インキュベートした。MCRは、標識反応に使用したタンパク質1モルあたりのビオチン標識またはフルオレセイン標識（ハプテン）のモル数として定義される。

25mLのPBSで平衡化したPharmacia PD-10カラムに反応液を通すことにより、未反応の標識を抗体から分離した。タンパク質濃度とモル取り込み比（MIR）は、Threshold System Operator's ManualのILAセクションに記載されているように計算した。MIRは、タンパク質1モルあたり共有結合した標識の平均モル数として定義される。標識抗体は ILA Assay Buffer で 10 µg/mL に希釈し、250 µL のアリコートを-20℃で保存した。1.0mg/mLで標識した抗体のMIRは、ビオチン化ニワトリ抗タンパク質Aで4.1、蛍光標識ニワトリ抗タンパク質Aで4.6であった。ニワトリ抗タンパク質A抗体の標識の違いにより、バックグラウンド率（μV/秒）に若干のばらつきが認められたが、感度とダイナミックレンジは一貫していた。

試験あたりの最適な抗体濃度の決定（負荷試験）

各標識抗体の4つの濃度（12.5、25、50、100 ng/test）を3つの分析物濃度（0、50 pg/mL、500 pg/mL）で試験し、バックグラウンド率とスロープを評価した（一般的なアッセイプロトコルについては次ページ以降を参照）。ビオチン化抗体と蛍光標識抗体を同量オンサイトで使用したのは、同じポリクローナル抗体が標識されているため、両方の標識抗体が分析物上の同じ結合部位で競合するためです。ビオチン化抗体と蛍光標識抗体を同量ずつ使用することで、分析物とビオチン化抗体と蛍光標識抗体が結合する確率が最も高くなります。各標識抗体の50 ng/testは、最小バックグラウンド率（0 pg/mL Protein A）と分析物存在下での最大勾配（50および500 pg/mL Protein A）の間の最良の妥協点であった。このアプリケーションノートの残りの実験では、この抗体の組み合わせを使用した。

測定プロトコール

ステップ 1 Protein A標準曲線をポリプロピレンチューブに調製する。Protein A標準物質をAssay Bufferで希釈する。標準品は 20 pg/mL～5000 pg/mL の範囲です。

ステップ 2 サンプルをポリプロピレンチューブのAssay Bufferで希釈します。

ステップ 3 ビオチン化抗体と蛍光標識抗体をそれぞれ 50 ng/test（500ng/mL）の濃度でアッセイバッファーと混合し、ポリプロピレンチューブに調製します。

ステップ 4 Protein A 標準品と検体をそれぞれ 100 µL ずつ適切なチューブに分注します。

ステップ5 ステップ3で調製した抗体100μLを、エッペンドルフのリピーターピペッターとCombitip® を用いてチューブに分注します。

ステップ6 チューブをパラフィルムで覆い、ラックを振って混合し、室温で2時間インキュベートします。

ステップ7 キャプチャー試薬を25mLのアッセイバッファーで希釈します。再構成したキャプチャー試薬をアッセイバッファーで1：10に希釈します（キャプチャー試薬1容量＋アッセイバッファー9容量）。インキュベーションが終了したら、希釈した Capture Reagent 1 mL をエッペンドルフのリピーターピペッターと Combitip を用いて各チューブに分注します。

ステップ 8 反応混合物をろ過ユニットに移す。フィルターベースとフィルターブロックは新品でも再使用でもかまいません（洗浄方法については ILA 検出キットの添付文書を参照）。低真空でフィルタリングする。

ステップ 9 フィルタリングの間に、酵素試薬をバイアルあたり 4 mL のアッセイバッファーで再構成します。再構成した酵素試薬の1：10希釈液を調製します（酵素試薬1容量＋アッセイバッファー9容量）。

ステップ 10 フィルタリングユニットのウェルが空になったら、各ウェルに Wash Buffer 2 mL を分注し、高真空でフィルタリングする。真空を切ります。

ステップ 11 希釈した酵素試薬 1 mL を、エッペンドルフのリピーターピペッターとコンビティップを使って各ウェルに分注し、低真空でフィルタリングします。

ステップ 12 フィルタリングユニットのウェルが空になったら、各ウェルに洗浄液を 2 mL ずつ分注し、高真空でフィルタリングする。

ステップ13 ウエルが空になったら、真空を止め、スティックを読み取ります。

アッセイ特性評価

標準曲線

標準曲線の最低キャリブレーターは、バックグラウンド速度より30～50µV/sec増加する組換えプロテインAの濃度を計算することにより選択した。計算は、負荷試験で観察された勾配を用いて行った。他のキャリブレーターは、アッセイの許容範囲である20 pg/mLから5000 pg/mLに均等に分布させた（図1は、プロテインA濃度が5000、2500、1250、625、156、40、20、0 pg/mLの標準曲線を示している）。二次方程式が標準曲線を最もよく定義した。

インキュベーション時間

最適なインキュベーション時間を決定するためにカイネティック研究を行った。4レベルの分析物（0 pg/mL, 100 pg/mL, 700 pg/mL, 2000 pg/mL）を標識抗体とともに30分、1時間、1.5時間、2時間、4時間インキュベートした。標準曲線、* (0 pg/mL)、# (1250 pg/mL)のサンプルは全スティックとも4時間インキュベートした。反応は4時間では平衡に達しなかった（図2）。このアプリケーションノートの残りの実験では、便宜上、また十分なダイナミックレンジが得られたため、2 時間のインキュベーション時間を選択しました。選択したインキュベーション時間が標準曲線の特徴付けに当初使用した時間と異なる場合は、新しいインキュベーション時間を使用して標準曲線範囲を再定義する必要がある場合があります。

検出限界

検出限界の評価についてはThreshold System Operator's Manualを参照してください。この特異性アッセイでは、20 pg/mL Protein Aをバックグラウンドから4標準偏差の分離で検出できます。

アプリケーション

アッセイ性能は、いくつかの抗体種およびサブクラスの存在下で検討されました： MuIgG1、MuIgG2a、MuIgG2b、HuIgG。組換えプロテインAのスパイク回収率と検出限界は、これらの製品抗体の存在下で測定されました。

製品抗体存在下でのスパイク回収率

500pg/mLの組換えプロテインAスパイクの回収率を、様々な種およびサブクラスの抗体存在下、様々な濃度で試験した。各実験には緩衝液コントロールが含まれた。スパイク回収率は以下のように計算した：

許容可能なスパイク回収率は100%±20%と定義した。スパイクの完全回収を可能にした各サンプル抗体の濃度を表 1 に示す。

製品抗体存在下で測定した検出限界

各抗体種およびサブクラスの存在下での検出限界は、表 1 に示す各サンプル抗体の濃度を用いて決定しました。検出限界は、100万分の1（ppm）または10億分の1（ppb）のプロテインAの質量／抗体の質量で表した（表2）。

概要

本アプリケーションノートのデータは、インキュベーション時間2時間、各標識抗体50 ng/試験で作成されました。これらの条件により、高感度（25ppb～4ppm）で定量的なアッセイが、広いダイナミックレンジ（2.5 logs）で汚染プロテインAを測定することができます。例えば、インキュベーション時間を長くすることで、より高い感度を得ることができます。逆に、インキュベーション時間を短くすることで、感度の低い迅速なアッセイを開発することもできる。試験された様々な製品抗体について決定された検出限界レベルは、全ての抗体を代表しているとは限らない。アッセイ性能のバリデーション、特に検出限界は、試験した各製品抗体について決定する必要があります。

参考文献

1. Harlow E. and Lane D. Antibodies： A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor pp.