Application Note SpectraMaxマルチモードマイクロプレートリーダーでの
IMAPホスホジエステラーゼアッセイ

はじめに

Molecular Devices社のIMAP® テクノロジーは、キナーゼ、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼの迅速、ホモジニアス、非放射性アッセイを可能にし、アッセイ開発とハイスループットスクリーニングの両方に適しています。IMAPアッセイは、ナノ粒子上に固定化された金属配位錯体へのリン酸の結合に基づく。IMAP結合体がリン酸化基質に結合すると、ペプチドの分子運動が変化し、ペプチドに結合した蛍光標識の蛍光偏光（FP）が増加する（図1左）。このアッセイのTR-FRETバージョンでは、テルビウム（Tb）ドナーが含まれるため、リン酸化基質が存在すると蛍光エネルギー移動が起こる（図1、右）。このアッセイは時間分解モードで検出されるため、アッセイ成分やスクリーニング中の化合物による蛍光干渉がほとんどない。TR-FRETは、基質のサイズや濃度にも柔軟に対応できる。

環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（PDEs）は、様々な生物学的プロセスに関与するセカンドメッセンジャーであるcAMPとcGMPのホスホジエステル結合を分解する酵素群である。PDEsは、心臓病、認知症、うつ病などの領域で臨床的に重要であるため、薬剤の標的として重要なクラスとして浮上してきた。このアプリケーションでは、SpectraMax®i3、SpectraMax®Paradigm®、SpectraMax®M5、およびFlexStation®3マルチモードマイクロプレートリーダーとSoftMax®Proソフトウェアを使用したIMAPテクノロジーによるPDE酵素希釈および阻害曲線の測定方法を紹介します。

材料

• IMAP FP PDE評価キット（Molecular Devices P/N R8175）
• IMAP TR-FRET PDE 評価キット（Molecular Devices P/N R8176）
  ◦IMAPプログレッシブ結合試薬
  ◦IMAPプログレッシブバインディングバッファーA (5X)
  ◦IMAP Progressive Binding Buffer B（5X）
  ◦TR-FRET Tbドナー
  ◦0.01%Tween-20含有IMAP反応バッファー（5X）
  ◦フルオレセイン標識cGMP基質（Molecular Devices P/N R7507）
• ウシ脳由来ホスホジエステラーゼ1、3'、5'-サイクリックヌクレオチド特異性 (Sigma P/N P9529)
• カルモジュリン（Sigma P/N P1431）
• 塩化カルシウム（主要実験室供給業者）
• DL-ジチオスレイトール（DTT）（主要な実験室供給業者）
• 384ウェルポリスチレン黒（FP用）および白（TR-FRET用）マイクロプレート（例：Corning P/N 3573および3572）

方法

酵素希釈シリーズ

完全反応バッファー（CRB）は1mM DTT、2500U/mLカルモジュリン、2.5mM CaCl2で調製した。フルオレセイン標識cGMP基質をCRBで希釈し、200nM（2X）の作業濃度とした。最適な基質濃度およびその他のアッセイパラメーターは以前に決定した（IMAP Assay Archive）。0.002U/mLから始まるPDE1酵素の1:3希釈系列をCRBで2倍作業希釈液として調製した。酵素反応は、黒色（FP）または白色（TR-FRET）の384ウェルプレートに、ウェルあたり20μLの容量で4重反復し、以下の添加を行った：

• 2X 酵素希釈液または酵素なし（CRB）10μL
• 10μLの2X基質溶液

緩衝液のみのコントロールでは、20μLのCRBをウェルに添加した。アッセイは室温で1時間インキュベートした。

阻害剤アッセイ

PDE1阻害剤8-MM-IBMXおよびザプリナストを、4倍の作用濃度でCRBに連続希釈した。両シリーズとも200μM（最終濃度）から開始し、1:3に希釈した。EC80濃度1.3 x 10-4U/mLのPDE1酵素を4倍作用溶液として調製した。反応は以下のように組み立てた：

• コントロール用の4X阻害剤またはCRB 5 μL
• 4X 酵素 5 μL
• 2X 基質溶液 10 μL

結合反応

各検出モードに特異的なIMAP結合液が調製された。FPの場合、バッファーA 75%、バッファーB 25%、および1:600の結合試薬が封じ込められました。TR-FRET用には、60% Buffer A、40% Buffer B、1:800 Binding Reagent、および1:400 Tb Donorが含まれた。バッファーのみのコントロールには、結合液から Tb ドナーを除いたものを用いた。60μLの適切なBinding Solutionを各アッセイウェルに加え、1時間（FP）または一晩（TR-FRET）インキュベートした。

検出

結合ステップの終了後、アッセイプレートをSpectraMax i3およびSpectraMax Paradigmリーダーで表1の設定を用いて読み取った。すべてのデータは、SoftMax Proソフトウェアを使用して取得および解析した。各アッセイに最適な設定と解析パラメーターを封じ込めたソフトウェアプロトコルは、結果の計算を簡略化するために事前に設定したものを使用した。各アッセイに最適な読み取り高さを確保するため、プレートを読み取る前にRead Height Adjustment手順を実行した。

*SoftMax Proソフトウェアでのこのプレート定義は、白黒プレートでも同じです。

表1. IMAP PDE アッセイ用の SpectraMax i3 リーダー設定。

結果

酵素希釈系列を実施することで、酵素とアッセイの性能が検証され、阻害剤スクリーニングアッセイに使用される酵素のEC80濃度を計算することができます。FPおよびTR-FRETアッセイモードの両方で、IMAPテクノロジーを用いてPDE1酵素希釈系列を実施した。EC50 値は、両方のアッセイタイプで非常によく一致し（図 2）、以前に発表された値と同様であった。陽性対照と陰性対照から計算されたZ'ファクターは、各アッセイで0.9以上であり、ハイスループットスクリーニングに適した頑健な性能を示した。阻害剤アッセイでは、FPとTR-FRETアッセイの両方の出力で同様のIC50値が得られた（図3）。

結論

IMAPテクノロジーは、キナーゼ、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼをスクリーニングするための均一性、非抗体ベースのプラットフォームを提供します。安定性とロバスト性があり、小型化が可能で、優れたZ'ファクター値を持つ高品質のデータが得られるため、阻害剤のスクリーニングに適している。他のいくつかの方法とは異なり、IMAPはより適切な結果を得るために直接結合を測定する。IMAP TR-FRETアッセイでは、直接Kmを決定することも可能である。

IMAPアッセイは次ページのシステムで実施できる。ここに示したデータは SpectraMax i3 リーダーで得られたものです。SpectraMax Paradigmリーダーでも同様の結果が得られており、高速デュアルPMT検出という利点もある。あらかじめ設定されたアッセイプロトコルを備えた SoftMax Pro ソフトウェアは、データ収集から解析までのワークフローを簡素化します。Molecular Devices社は、120種類以上の酵素、検証済みのプロトコール、キット、基質2に関するリファレンスデータを含むIMAP Assay Archiveを含む、完全なIMAPスクリーニングソリューションを提供している。

参考文献

1. Ahn、HS、Bercovici、A、Boykow、G、他（1997）。経口降圧活性を有するPDE1およびPDE5環状グアノシン一リン酸ホスホジエステラーゼの強力な四環系グアニン阻害剤。J. Med Chem. 40, 2196-2210.
2. IMAPアッセイ・アーカイブ　http://support.moleculardevices.com/assayarchive/index.html.

以下のMolecular Devicesシステムと互換性があります。

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