Application Note マイクロ流体システム、磁性ナノ粒子、
ハイコンテントイメージャーを用いたin vitro 3Dがんアッセイ

はじめに

Oksana Sirenko, PhD | Applications Scientist | Molecular Devices
Matthew Hammer | Applications Scientist | Molecular Devices

近年、研究や医薬品開発のために生理学的に正確な3D細胞モデルを持つ必要性が着実に高まっている。研究者たちは、疾患と正常な生理学の両方を理解するために、様々な3D細胞モデルの形成と維持を完成させてきた(1,2)。複雑なアッセイを、貴重なサンプル、特に患者由来の材料で、簡単かつ迅速に実行する能力が、いくつかの制限要因となってきた。スフェロイドやオルガノイドの手作業による処理、染色、加工は一般的に手間がかかり、サンプルの破壊や紛失が起こりやすい。さらに、オルガノイドはウェルの端に配置される傾向があり、あるいはウェル内の異なる位置や高さに配置されることがあるため、ハイコンテントイメージャーは困難な場合がある。また、マルチウェルプレートで薬物治療やアッセイを行う場合、1サンプルあたりの読み出し回数が制限される。

このプロセスを合理化し、容易にする新技術が急速に開発されつつある。私たちは、マイクロフルイディクスシステムPu-MAシステム® 3D MAGと3Dフローチップ（Protein Fluidics社製）を用いて、磁性コーティングされた3D細胞モデルを用いた自動アッセイステップを実施した（図1）。磁性ナノ粒子NanoShuttle™(3)でコーティングされた3D細胞モデルは、埋め込まれた磁石を用いてフローチップのウェルに移され、センタリングされた。自動マイクロ流体システムにより、培地交換、化合物添加、微小組織の処理が自動化された。次に、ImageXpress® マイクロコンフォーカルハイコンテントイメージングシステム（Molecular Devices社製）を用いて、スフェロイドやオルガノイドの形態や化合物の効果を特徴づけ、定量化する高度な解析とともに、3D構造解析を効率的に行った。

つの複雑な3Dアッセイの自動ワークフローを実演した：

• 3D癌スフェロイドの薬剤処理、染色、解析： HeLaスフェロイドを化合物で24～48時間処理した。自動化された生存率染色を用いて、化合物処理の濃度応答曲線を決定した。
• 薬剤感受性の評価とバイオマーカーの免疫蛍光分析： トリプルネガティブ乳がん（TNBC）患者由来オルガノイド（PDO）(4)の薬剤感受性を評価した。PDOをIFマーカーで染色し、フローチップで画像化した。

Pu-MAシステムと3D MAGのワークフロー

Pu-MAシステムと3Dフローチップは、自動化されたオルガノイドアッセイを合理化するために設計された。Pu-MAシステム3D MAGは、標準的なPu-MAシステムデバイスに3D MAGの改良を加えたもので、アッセイステップ中、保護されたサンプルチャンバー内に磁気コーティングされた3D細胞モデルを保持することができます（図1および2）。

3DスフェロイドのNanoShuttle処理はGreiner Bio-Oneのプロトコールに従って行われた(3)。ここでは、このバイオプリンティングプロセスと我々の自動アッセイシステムを組み合わせた新しい利用法を示す。

磁化された3D細胞モデルは、磁性ナノ粒子でコーティングされたオルガノイドのセンタリングと保持を確実にする小型（φ1mm～）磁性ロッドを封じ込めたローディングトレイを使って、フローチップに移された（図2）。その後、フローチップをインキュベーター内のシステムに入れる。Pu-MAシステムのシステム構成と、流体の移動に空気圧を使用することで、インキュベーター環境内のサンプルチャンバーにガス交換が行われる。

フローチップは、マルチチャンネルや自動液体分注システムに適合する便利なマルチウェルプレートフォーマット（384ウェル間隔 SLAS/ANSI標準）で設計されています。底面は光学的に透明で、蛍光イメージャーや共焦点イメージングシステムでのイメージングが可能です（図1）。これは、アッセイ全体を通して磁気コーティングされた3Dモデルの位置を中央に維持する機能とともに、すべてのサンプルウェルで同じ3D画像取得フィールドを自動化することを容易にします。さらに、ImageXpress® マイクロコンフォーカルシステムのロバスト性オートフォーカス機能は、各サンプルウェル内のスフェロイドまたはオルガノイド全体の高解像度画像の取得に役立ちます。

3Dがんスフェロイドの薬剤処理、染色、イメージング

マイクロ流体サンプル処理と磁気ビーズを用いたワークフローの応用は、HeLaスフェロイドを用いて、選択した細胞毒性薬剤処理の効果に対する細胞生存率と細胞死について実証された(5)。HeLa細胞は、Greiner Bio-One(3)のプロトコールに従って、撥細胞性表面の384ウェルマイクロプレートに2,000個/ウェルで磁気バイオプリントされた。NanoShuttleでコートしたHeLa細胞を37℃、5% CO2で1時間、磁気ホールドドライブの上でインキュベートした。その後、形成されたスフェロイドをフローチップウェルにプレーティングし、Pu-MA System 3D MAGを用いて処理する前に、プレートをインキュベーター内に1日放置した。

以下の例では、HeLa 3Dスフェロイドを異なる化合物濃度（スタウロスポリン、0～10μM）で22時間自動処理した後、培地を染色液に交換して2時間インキュベートし（カルセインAM、ヘキスト、エチジウムホモダイマー1）、サンプルをPBSで洗浄した。

処理工程の後、フローチップを装置から取り出し、ImageXpress® Micro Confocal Imagingシステムを用いてフローチップ内の画像を撮影した。画像は10Xまたは20X対物レンズを用い、510μm間隔で12～20枚の3D Z-stackで取得し、MetaXpress®ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェアのシンプルなカスタムモジュールを用いて2Dプロジェクション画像を解析し、細胞生存能を迅速に定量化した（図3）。MetaXpress®ソフトウェアを用いて、スタウロスポリン処理時の全生細胞数または死細胞数を定量した。ライブデッド解析アプリケーションモジュールは、2Dプロジェクション画像（最大投影）またはカスタムモジュールエディターによる3D解析のいずれかに使用した。

原発性腫瘍3Dモデルにおけるin vitro薬剤感受性アッセイとバイオマーカー検出

患者由来オルガノイド（PDO）は、TU-BcX-4IC（原発性トリプルネガティブ乳癌由来のセル）をタイトスフェアに増殖させたものから、既述のように形成した(4)。ここでは、オルガノイドの形成にマイクロパターンプレートを使って、この方法をさらに最適化した。24ウェルAggreWell™ 400マイクロウェルプレートの1ウェルを用いて、約1200個の安定した大きさのPDOを作製することができた。オルガノイドを形成させるために、TU-BcX-4IC細胞をマイクロウェル当たり2,000個の密度でプレーティングし、プレートを2日間培養してコンパクトな3Dオルガノイドを形成させた。100μlのNanoShuttleをウェルに添加し、オルガノイドをNanoShuttleとともに3時間インキュベートした後、PDOを採取してフローチップに移した。本試験で使用した薬剤はロミデプシンとトラメチニブである。3Dオルガノイドを異なる濃度の薬剤で48時間処理した。その後、自動薬物処理と免疫蛍光染色がPu-MAシステム3D MAG内で行われた。生きたサンプルを上記のように生存率染色（カルセインAM、ヘキスト、エチジウムホモダイマー1）で染色した後、サンプルをImageXpress® Micro Confocalシステムでイメージングし、MetaXpress®ソフトウェアのLive-Dead解析モジュールを用いて解析した（図5Aおよび5B）。画像は共焦点Z-スタック画像として取得され、スタック画像は細胞生存率を解析するための2Dプロジェクション画像に圧縮された。マルチパラ メトリックリードアウトが生成され、濃度応答曲線が解析された（図4A、4B）。

生細胞と死細胞のパーセンテージは分析により決定され、化合物の有効濃度の算出に用いられた。次にサンプルを固定し、特異性マーカーであるE-カドヘリンとCD44を再染色した。

ロミデプシン処理後、PDOの特異性マーカーに対する免疫蛍光染色をPu-MAシステム内で行った。図5Cに示すように、E-カドヘリンとCD44マーカーが処理後のPDOで検出された。共焦点画像はImageXpress® Micro共焦点イメージングシステムを用いて取得した。その結果、E-カドヘリンの発現低下と同様に、薬剤処理によるPDOの崩壊が示された。

結論

我々は、Pu-MAシステム3D MAG上の磁性コート3D細胞マイクロティッシュを用いたアッセイワークフローの改善と、ImageXpress Micro Confocal イメージングシステムを用いたハイコンテントイメージングおよび解析を実証した。自動ワークフローとPu-MAシステム3D MAGを組み合わせることで、オルガノイド／スフェロイドの自動処理、分泌因子のin situ培地サンプリング、薬物処理とマルチパラメトリー解析、バイオマーカーの免疫蛍光染色を行う能力が向上した。

合理化されたワークフローとPu-MAシステムのプロトコルを用いて、異なる薬剤と濃度に反応する異なる3D細胞モデルを用いた染色とイメージングを示しました。我々は、3D腫瘍サンプルにおける薬剤感受性の迅速な評価に使用できる、サンプルの自動薬剤処理、染色、処理、ならびに生存率、マーカー発現、およびイメージングによる表現型の変化の解析を実証した。

参考文献

1. ヒトオルガノイド： 生物学の理解と疾患治療のためのツール。Schutgens, F. and H. Clevers, (2020) 15(1): p. 211-234, Ann. Rev. of Pathology： Mech. of Disease.
2. オルガノイドの簡単な歴史。Corro C. et al. (2020) 319: C151-C165, Am. J. Physiol.
3. 磁気浮上による三次元組織培養。Souza, G.R. et a.l (2010) 5(4)： 291, Nat. Nanotechnol.
4. 新しいトリプルネガティブ乳癌患者由来異種移植モデルにおける薬剤耐性プロファイリング。Matossian, M.D. et al (2019) 19(1)： 205, BMC Cancer.
5. 3Dがんスフェロイド培養の生存率と形態を特性化するためのハイコンテントアッセイ。Sirenko, O. et al. (2015) 13, 402, Assay and Drug Dev Tech.

謝辞

Matthew Burow博士およびMargarite Matossian博士（Tulane University）。NanoShuttleはGreiner Bio-Oneの好意により提供された。