Application Note 共焦点イメージングを用いた無洗浄アッセイにおける感度の向上
- 高SB比の鮮明な画像を取得するための感度向上
- 任意の波長で二次標識の検出が可能
- 同一ウェル内で異なる細胞をマルチプレックスする
- 1536ウェルプレートまでスケールアップ可能
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はじめに
ハイブリドーマ上清の細胞表面抗原に対する抗体探索は、ワクチンや治療用抗体の探索・開発において重要なステップである。これらのアッセイの感度は、狭い被写界深度を利用して、SB比が高く、ピンボケのない鮮明な画像を取得するなど、共焦点イメージングの光学的特性を利用することで向上する。
ホモジニアス抗体結合アッセイは、洗浄不要のフォーマットで、細胞やビーズへの表面結合の迅速なスクリーニングを可能にします。懸濁セルやビーズをハイブリドーマ上清の抗体検査に使用することができ、従来のアッセイで必要だった分注や吸引のステップを省くことで、セルロスを減らすことができます。
ImageXpress®マイクロコンフォーカルハイコンテントイメージングシステムを用いたイメージングにより、細胞表面への結合をピンポイントで検出することができ、異なるマーカーを識別する複数の蛍光物質を同一ウェル内で結合させ、培地や蛍光物質によるバックグラウンド蛍光を除去することができます。
ホモジニアス抗体結合アッセイ手順
フロー図（図1）にアッセイ手順を示す。まず、分析物の表面エピトープ（またはターゲット）を発現するビーズまたはセル、分析物自体、および蛍光検出抗体を結合させる。このステップに続いて、サンプルを室温で数時間または4℃で一晩インキュベートした後、ウェルを画像化して分析する。
図1. アッセイワークフロー
ビーズへの精製IgG結合の高感度検出
マイクロプレートベースアッセイでは、抗体コートマイクロスフェアを蛍光標識二次抗体と組み合わせ、384ウェルプレートに添加した。次に、分析物（この場合はヒトまたはマウス抗体）の滴定をウェルに加え、用量反応曲線を作成し、検出下限を決定した。試薬濃度は最適化され、使用された材料は表1に示されている。
10X Plan Apo対物レンズを用い、1ウェルあたり1視野を取得した。画像はMetaXpress® ハイコンテント画像解析ソフトウェアでCell Scoring Application Module（ヒト抗体検出用）とカスタムモジュール（マウス抗体または1ウェル内のマルチプレックスビーズの組み合わせ用）を用いて解析し、検出下限（LLD）と分析物の線形応答を決定した。一次抗体滴定実験の曲線は、ホモジニアス抗体結合アッセイに関連するよく知られたプロゾーンまたは「フック効果」を示す（図2C）。この曲線の上端でのシグナルの落ち込みは、培地中の過剰な未結合分析物が二次抗体に結合し、細胞やビーズに結合できなくなるために起こる（図2B）。
| 消耗品 | ベンダー/部品番号 | 説明 | ウェルの最終状態 |
|---|---|---|---|
| 非標識ヤギ抗マウスコートビーズ | Spherotech, PN: MPFc-60-5 | 7.4 µm diameter | 7,500 beads |
| マウス lgG | ジャクソン・イムノリサーチ, PN: 009-000-003 | Chromopure | 0.1-100 ng/mL |
| AlexaFluor 546標識ヤギ抗マウスlgG | ライフ・テクノロジーズ, PN: A-11030 | 200 ng/mL | |
| ブルーヤギ抗ヒトコート・ビーズ | Spherotech, PN: HPBFc-30-5 | 3.5 µm diameter | 7,500 beads |
| ヒトlgG | ジャクソン・イムノリサーチ, PN: 009-000-003 | Whole molecule | 0.1-100 ng/mL |
| AlexaFluor 488標識ヤギ抗ヒトlgG | ライフ・テクノロジーズ, PN: 11013 | 200 ng/mL | |
| アッセイバッファー | タンパク質と洗浄剤を添加し、凝集を抑える | PBS + 5% FBS + 1 mM EDTA + 0.05% Tween-20 | |
| 384ウェルポリスチレン・マイクロプレート | Greiner, PN: 781091 | クリアボトムの厚み<200 µm |
表 1. ビーズの均一性抗体結合アッセイのための材料
図2. ホモジニアス抗体結合アッセイ。A. ウェルの底面に位置する細胞または抗体固相化ビーズからのシグナルのみが検出される。B 分析物の濃度が結合タンパク質の濃度より高い場合、培地中の二次抗体と結合しすぎて、検出される蛍光強度が低下し、ホモジニアスアッセイによく見られる「フック効果」が生じる。C ホモジニアスビーズアッセイにおけるフック効果の例。
共焦点光学系を用いた感度の向上
市販のポリスチレンマイクロスフェアを利用した代表的な2種類のビーズベースアッセイを開発した。アッセイ性能を比較するため、60 µm のピンホールを用いてワイドフィールドおよび共焦点モードでイメージングを行った（図 3）。ワイドフィールドと共焦点画像取得の比較では、共焦点画像取得の方が4～8倍高感度な抗体検出が可能であることが一貫して示された。
マルチプレックスにより、半分の時間で取得と解析が可能
ヒトIgGに対する抗体をコーティングした直径3µmのビーズとマウスIgGに対する抗体をコーティングした直径7µmのビーズを1つのウェルに組み合わせることで、マルチプレックスアッセイを行うこともできます。小さい方の抗ヒトビーズはCy5の波長スペクトルで蛍光を発します（⊖647 ex/670 em）。ウェルに添加した分析物は、精製マウスIgG、精製ヒトIgG、または両者の組み合わせのいずれかの1：2希釈液であった。それぞれの二次抗体は異なる波長の蛍光色素で標識されていたため、両方の抗体種の結合を別々に正確に測定することができた（図4）。
*図3. 上図：ワイドフィールドまたは共焦点光学系で取得した各抗体の結合曲線を比較すると、共焦点画像を用いた方がより高感度な検出が可能であることがわかる。SB比は、ビーズの蛍光強度を、分析物非存在下でAlexaFluor 488標識二次抗体とインキュベートしたビーズの平均強度で除して求めた。共焦点イメージングを用いた検出下限（LLD）は0.3ng/mLであるのに対し、ワイドフィールドでは2.3ng/mLであった。**下： ワイドフィールド画像では、視野内のバックグラウンドが高く（緑）、SB比が低いことが各画像の黄色文字で示される。プレーティングは10倍の倍率で撮像し（ただし、ここでは表示のためにズームしている）、1視野に1000個以上のビーズが見えた。
図4. ヒトまたはマウスIgG検出用抗体でコートしたビーズを組み合わせたマルチプレックス。A. 左：画像は抗体複合体が形成されていない各ビーズタイプを示す。中央： 赤が蛍光イメージャーの抗ヒトビーズ、モノクロが非標識の抗マウスビーズ、緑/赤のオーバーレイがヤギ抗ヒトAF488結合、青/モノクロのオーバーレイがヤギ抗マウスAF546結合を示す。右： 透過光画像では、抗ヒトビーズが抗マウスビーズと並んで小さく見えるが、ソフトウェアが2つのビーズ集団を分離して解析する。右のセグメンテーションマスクは抗ヒトビーズを黄色、抗マウスビーズを青色で示す。） 説明のため、画像は20倍の対物レンズで撮影し、ビーズを明瞭に表示するためにズーム倍率を変えてある。B. バックグラウンドを差し引いたシグナルをプロットすると、このマルチプレックスアッセイにおけるLLDはヒト抗体で1.2 ng/mL、マウス抗体で0.3 ng/mLであることがわかった。
マルチプレックスビーズアッセイの性能を評価するために、単一の抗体について分析した場合と比較するために、サイドバイサイドアッセイを行ったところ、抗体分析物の検出下限は常に2ファクター以内であった（データは示さず）。
ハイブリドーマ上清の分泌抗体のスクリーニング
この実験では、ハイブリドーマ上清の96ウェルプレートをスクリーニングした。上清は全濃度と、表1に示したアッセイバッファーで1:10に希釈した後の両方で試験した。抗ヒトIgGでコーティングしたビーズを蛍光標識二次抗体と組み合わせ、50μLを384ウェルプレートに添加した。最後に上清を加え、室温で4時間インキュベートした。全濃度で検査した上清には、FITC波長で蛍光を発する大きな粒子が含まれていることが多いため、ビーズに特異的に関連する蛍光を測定するCell Scoring Analysis Moduleを利用する前に、分析から破片を除去するステップを追加したカスタムモジュールを作成した（図5）。ウェルのモンタージュ表示により、抗体を封じ込めた上清を即座に特定できる（図6）。
図5. 上清画像中のビーズに関連しない大きな蛍光アーチファクトをフィルタリングで除去した。矢印は、左側のビーズ（赤）と標識抗体（緑）の重ね合わせ画像におけるアーチファクトと、右側のセグメンテーションマスク（黄）におけるアーチファクトの除去を示す。
図6. 上清を1:10希釈したウェルのサムネイル画像と、各ウェルのビーズ上で測定した蛍光強度を表すヒートマップ。ヒートマップ図（上）では、赤色ウェルはビーズに結合した抗体の量が多く、緑色ウェルは最も少なかった。サムネイルモンタージュ（下）では、ビーズ上に集中するのではなく、バックグラウンドに結合していない蛍光体が多いウェルが、同じ強度スケールで見ると最も明るい緑色に見える。
結論
ImageXpress®マイクロ共焦点システムを用いた均一性抗体結合アッセイのイメージングでは、蛍光標識抗体が培地中に豊富に存在する場合でも、低いバックグラウンドシグナルに対して、ビーズや細胞に結合した蛍光標識抗体の鮮明な画像が得られます。MetaXpress®解析ソフトウェアを使用して、一般的なアッセイのアーチファクトを除去することで、よりクリーンで正確な結果が得られます。さらに、このプラットフォームは、アッセイ感度を損なうことなく、任意の波長での二次標識の検出、同一ウェル内の異なるセルのマルチプレックス、1536ウェルプレート実験へのスケールアップに柔軟に対応します。
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