Application Note FLIPRテトラシステムによるライブ細胞Gi-および
Gs-共役GPCRセカンドメッセンジャーシグナル伝達
- GloSensor cAMP 細胞株および GloSensor cAMP プラスミドを用いた柔軟なアッセイ開発
- 主要なクラスのGPCRサブタイプの速度論的スクリーニングのための完全なソリューション
- 複数のマイクロプレートフォーマットに対応するスケーラブルなアッセイスループットと自動化への容易な統合
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はじめに
このアプリケーション・プロトコールでは、FLIPR Tetra® High Throughput Cellular Screening System 上で、発光性ホタルルシフェラーゼをベースとした Promega GloSensor™ cAMP アッセイを改良し、cAMP を介した Gs および Gi 共役 GPCR 活性をキネティック・モードで検出できるようにしたことを示します。このアッセイにより、これらのGPCRサブタイプは、関連するセカンドメッセンジャー機構である細胞内cAMP濃度の変化を測定するライブセルアッセイで評価できるようになりました。
GsおよびGi共役GPCRセカンドメッセンジャーシグナル活性の検出は、従来、放射性結合アッセイや終点cAMPアッセイなど、細胞溶解を必要とするアッセイを用いて行われてきた。このようなアッセイは、細胞応答における単一の時点における活性を測定するものであり、動態学的な情報は得られない。もう一つの方法は、Gs-およびGi-GPCRをGα16に強制結合させ、アゴニスト受容体の活性化に伴うカルシウムフラックスを蛍光検出する方法である。このアッセイも、生体関連cAMP経路を介したシグナル伝達を行わないため、最適とは言えない。
我々は、GloSensor プラスミドを安定的に発現する CHO-K1 細胞株および HEK 293 細胞株における内因性受容体活性を実証した。さらに、GloSensor プラスミドを一過性にトランスフェクトした細胞株で、Gs-および Gi-共役型受容体活性を測定した。GloSensor cAMPアッセイと組み合わせることで、FLIPR Tetraシステムは、主要なクラスのGPCRサブタイプの動態スクリーニングのための柔軟で完全なソリューションを提供します。
図1に見られるように、GloSensor cAMPアッセイは、ネイティブなホタル ルシフェラーゼの野生型N末端とC末端にcAMP結合ドメインを融合させ て作製された。cAMP非存在下では、cAMP結合ドメインを含む遺伝子組み換えルシフェラーゼは不活性状態にある。cAMPに結合すると、cAMP結合ドメインのコンフォメーションが変化し、活性化状態の発光が増加する。ルシフェラーゼの両形態は、ルシフェラーゼ基質存在下で表される。GloSensor cAMP アッセイに関する詳細は、テクニカルマニュアル（Cat# TM076、Promega）を参照。一過性または安定性トランスフェクション用のプラスミドを組み合わせることで、柔軟なGi-およびGs共役GPCRアッセイ設計が可能である。プロメガ社から入手可能な細胞株または研究室で入手可能な標的細胞株を用いた4つのオプションを以下に示す：
図1. GloSensor cAMP アッセイの細胞内バイオセンサー。図提供：プロメガ社
柔軟なGloSensor cAMPアッセイデザイン
- 安定型受容体と安定型 GloSensor cAMP アッセイ
- 一過性受容体と安定型GloSensor cAMPアッセイ
- 安定型受容体と一過性GloSensor cAMP測定法
- 一過性受容体と一過性GloSensor cAMP測定法
FLIPRテトラシステムについて：
- フレキシブルなICCDカメラにより、蛍光検出だけでなくルシフェラーゼアッセイ用の発光検出も可能
- FLIPR Tetraシステムに搭載されたICCDカメラにより、生細胞でのキネティックcAMP発光シグナル測定が可能
- スケーラブルなアッセイスループット：96、384、1536ウェルプレートフォーマット。
材料
cAMP細胞株とプラスミド
- GloSensor cAMP HEK 293 安定細胞株（プロメガ社、Cat.#E1261）
- GloSensor cAMP 23F CHO K1 安定細胞株（プロメガ R&D 社製）
- ラット Y2R/GloSensor cAMP 23F CHO-K1 二重安定細胞株（プロメガ R&D 社製）
- GloSensor cAMP アッセイプラスミド pGlosensor-22FcAMP （Promega, Cat.）
- ドーパミンD4安定HEK 293T細胞株（Multispan Inc.）
図 2. Stable GloSensor cAMP-23F HEK 293 細胞。Stable GloSensor cAMP-22F HEK 293 細胞株は、FLIPR Tetra システムで GloSensor cAMP アッセイを実証するために使用される。ICCDカメラは、修飾ホタルルシフェレースの発光シグナルを30分間にわたって検出する。(A) サルブタモール刺激に対するcAMP HEK 293内因性Gsを介した内因性β2アドレナリン受容体応答のFLIPR ScreenWorks平均シグナルトレース。このトレースは、ベースライン信号の約350倍の増加を示している。(B）イソプロテレノールに対するHEK 293細胞株内因性β2アドレナリン受容体のフルアゴニズム、およびサルブタモールによる部分的受容体アゴニズム。
細胞培養試薬
- HEK 293 細胞増殖培地：90% DMEM（Life Technologies 社、Cat. #11995- 065）、10% FBS（Hyclone 社、Cat. #SH.30071）、200 µg/mL ハイグロマイシン B（Sigma 社、Cat. #H3274)
- GloSensor cAMP-23F CHO-K1 細胞増殖培地：90% F-12 Medium (Life Technologies, Cat. #11765), 10% FBS, 200 mg/mL hygromycin B)
- Glo Sensor cAMP-23F/Y2R CHO-K1 二重安定細胞増殖培地：90% F-12 Medium (Life Technologies, Cat. #11765), 10% FBS, and 200 µg/mL hygromycin B), and 500 µg/mL G418 (Life Technologies, Cat. #10131027)
図3. イソプロテレノールとサルブタモールの拮抗作用。つの既知の阻害剤によるイソプロテレノールとサルブタモール反応の拮抗作用。(A）EC80イソプロテレノール反応の阻害。(B）EC80サルブタモール反応の阻害。ロバストシグナルウィンドウはZ因子>0.7を可能にする。
アッセイ試薬
- プレーティング培地：90% CO 2非依存培地（Life Technologies, Cat.#18045）、10% FBS
- HEPESバッファー： HEPESを脱イオン水で10mMに再懸濁し、KOHを用いてpHを7.5に調整する。
- GloSensor cAMP 試薬ストック溶液： 250 mg の GloSensor cAMP 試薬（Promega、カタログ番号 E1291）を 8.17 mL の HEPES 緩衝液に懸濁する。
- 平衡化培地： 最適化が必要。
- 化合物：(-)-イソプロテレノール（Sigma、Cat.#I6504）；サルブタモール（Sigma、Cat.#S8260）；プロプラノロール（Sigma、Cat.#P0884）；ピンドロール（Sigma、Cat.#P0778）；アルプレノロール（Sigma、Cat.#A8676）；ドーパミン（Sigma、Cat.#H8502）。
- ペプチドYY(3-36)、(Tocris Cat. #1618); すべての化合物ストック溶液は10 mMで作成し、HBSS + 20 mM HEPESでさらに希釈した。
図4. Gi -共役アゴニムの結果。Gi共役型受容体アゴニズムは、細胞内のcAMPの減少に相関したシグナルの減少をもたらす。ベースラインのcAMP活性上昇は、フォルスコリンの添加によって誘導された。CHO-K1細胞の安定なP2Y受容体を用いて、アゴニストの前または後にフォルスコリンを添加した場合の結果を比較した。(A) 10μMのフォルスコリン添加後、15分後にFLIPR TetraシステムでアゴニストであるペプチドYY(3-36)を添加。(B) ペプチドYY(3-36)は10μMフォルスコリン添加の15分前に添加した。アッセイの柔軟性に加え、どちらの方法もcAMP産生の阻害に関連したシグナルの減少を示している。
図5. Gi -共役型 D4 受容体を過剰発現する HEK 293 セル。Multispan 社の Gi - 結合ドーパミン D4 受容体を過剰発現する HEK 293 セルを GloSensor cAMP- 22F プラスミドで一過性にトランスフェクションした。リガンドをウェルにオンライン添加し、5 分間インキュベートした。アッセイを続けながら、FLIPR Tetra System に 10 µM のフォルスコリンを添加し、セル内の cAMP 産生を刺激した。(A）ドーパミンによるフォルスコリンを介したcAMP産生の阻害。(B）ドーパミンD4受容体特異性化合物PD168,077による、フォルスコリンを介したcAMP産生の阻害。
方法
安定したGloSensor cAMP細胞株アッセイ法
ステップ 1: 細胞を 384 ウェルブラックウォールクリアボトムプレート（Corning, Cat.#3712）に一晩プレーティングした。
ステップ2：アッセイ2時間前に培地を除去し、細胞をGloSensor cAMP試薬を封じ込めた30μL/ウェルの平衡化培地中で、5% CO2中37℃で1時間、室温で1時間インキュベートした。
- HEK 細胞株は、2% GloSensor cAMP 試薬を封じ込めた平衡培地でインキュベートした。
- CHO-K1 細胞株は、5% GloSensor cAMP 試薬でインキュベートした。
ステップ3：カイネティック測定中にFLIPR Tetra Systemで5倍の化合物を添加。
ステップ4：10～25分間、10秒または30秒ごとに露光。
ステップ5: 一般に、Gi-結合型レセプターアッセイではカイネティック測定が遅いため、全体として読み取り時間が長くなります。FLIPR Tetraインストゥルメンテーションのセットアップパラメータを表1に示す。
| パラメータ | セッティング |
|---|---|
| ICCDカメラモード |
発光 |
| ゲイン |
280,000 |
| ゲート |
100% |
| リード数 |
60–180 |
| 露光時間 |
1秒 |
| 読み取り時間間隔 |
10秒 |
| ピペッターヘッド |
384ウェル、黒色チップ付き |
| 吸引量 |
7.5 µL |
| ディスペンス高さ |
20 µL |
| 吐出速度 |
30 µL/秒 |
* 発光シグナル強度が低い場合は、9秒まで露光可能。条件を最適化する必要がある。
表1. FLIPR Tetraシステムのセットアップパラメーター。
図6. トランスフェクタント。GloSensor cAMP-22Fの一過性トランスフェクションおよびHEK 293細胞における内因性Gs共役型cAMP応答。(A）イソプロテレノールに対する応答、（B）プロプラノロールによる100 nMイソプロテレノールに対する応答の阻害。結果は、図2に示した安定なGloSensor HEK-22F細胞株を用いて行った実験から得られたものと同等である。
ステップ6：データをFLIPR ScreenWorks®ソフトウェアからGraphpad Prism 5にエクスポートして解析した。
安定的にトランスフェクトされたGPCR受容体細胞株と内在性受容体細胞株の両方における一過性のGloSensor cAMPトランスフェクション法
ステップ1：選択用抗生物質を含まないセルを、37℃、5％CO2のフラスコで一晩培養し、細胞が約70～80％コンフルエントになるようにする。
ステップ2： pGloSensor cAMPプラスミドをOpti-MEM-還元血清培地で20ng/mLに希釈し、ステップ4の1-µg DNA/mL細胞とする（Life Technologies社、カタログ番号31985）。
ステップ 3：FUGENE HDトランスフェクション試薬混合物（Roche、Cat. #0409705001）を1µg DNAあたり3:1の割合でマイクロプレートに加え、穏やかにピペッティングして混合し、室温で15分間インキュベートします。試薬は3:1の割合（μL）で使用する： DNA (µG)。
ステップ4: DNA複合体を、最近播種したセルを0.48万個/mL封じ込めたチューブに加える（HEK-D4の場合、12000個/25μL/ウェルで播種する。）
ステップ5：細胞株によって異なるが、8000～12000個/ウェルの細胞を25µL/ウェルでプレーティングし、37℃、5% CO2で2日間インキュベートする。
ステップ6： アッセイ当日、培地を静かに除去し、平衡化培地に2-6% f/v GloSensor cAMP試薬を30µL加える。
ステップ7：37℃で1時間、さらに室温で1時間インキュベートする。
ステップ8：表1のFLIPR Tetraシステムのセットアップパラメーターに従い、カイネティック測定中に6X化合物を添加する。
結論
FLIPR TetraシステムとGloSensor cAMPアッセイを併用することで、標準的なプレートリーダーを用いたエンドポイントアッセイでは不可能であったGi-およびGs共役型レセプターシグナル伝達のカイネティック測定が可能になる。
我々は、GloSensor cAMP細胞株および内在性ならびに安定的にトランスフェクトされたレセプター細胞株にトランスフェクトされたGloSensor cAMPプラスミドを用いて、アッセイ開発の柔軟性を示した。
謝辞
ピート・ステチャ、プロメガ・コーポレーション
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