Application Note SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットを
用いた低容量dsDNA定量法
- 貴重なサンプルDNAを保存
- スループットの向上とマイクロプレートの節約
- 幅広い濃度のアッセイ（0.5 pg/μL～200 ng/μL DNA）
PDF版（英語）
はじめに
二本鎖DNA（dsDNA）の定量は、qPCR、プラスミドトランスフェクション、次世代シーケンシングなど、多くの下流の分子生物学的実験の重要な前段階です。DNAの定量は一般的に紫外線（UV）分光光度法を用いて行われるが、この方法にはいくつかの限界がある。250ng/mL以下のDNAの定量には使用できず、比較的多量のサンプルを必要とする。また、RNAやタンパク質などの汚染物質の影響を受ける。dsDNA濃度の測定には、感度と特異性が高い蛍光測定法が適しています。
Molecular Devices社のdsDNA定量キットSpectraMax® Quantファミリーは、0.5 pg/µLから200 ng/µLまでの直線範囲で、dsDNAを非常に正確に定量することができます。通常、この蛍光測定アッセイは96ウェルマイクロプレートで行われます。貴重なサンプルやハイスループットが要求される場合には、384ウェルマイクロプレートでアッセイを行うことができます。
Molecular Devices社のdsDNA定量キットSpectraMax® Quantファミリーは、0.5 pg/µLから200 ng/µLまでの直線範囲で、dsDNAを非常に正確に定量することができます。通常、この蛍光測定アッセイは96ウェルマイクロプレートで行われます。貴重なサンプルやハイスループットが要求される場合には、384ウェルマイクロプレートでアッセイを行うことができます。
材料と方法
- SpectraMax® Quant™ AccuBlue™ Pico dsDNAアッセイキット（Molecular Devices cat.）
- SpectraMax® Quant™ AccuClear™ Nano dsDNAアッセイキット（Molecular Devices社カタログ番号R8356）
- SpectraMax® Quant™ AccuBlue™ HiRange dsDNAアッセイキット（Molecular Devices社カタログ番号R8358）
- UltraPure™ Calf Thymus DNA（Thermo Fisher社カタログ番号15633019）
- Greiner 384ウェル黒色平底マイクロプレート（Greiner cat.）
- Greiner 96ウェル黒色平底マイクロプレート (Greiner cat. # 655-076)
- SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダー
図1. SpectraMax Quant AccuBlue HiRange標準曲線を384ウェルマイクロプレートで測定。log-logカーブフィット処理。R2 = 0.999. PMTゲインはAutoに設定し、10フラッシュ/リード。
プロトコル
各dsDNA定量アッセイキットの作業溶液を、各製品の添付文書に従って調製した。50µLの作業溶液を384ウェルの黒色マイクロプレートの各ウェルにピペッティングした。2.5μLのDNAを各ウェルに添加し、マイクロプレートを振とうして適切に混合した。その後、マイクロプレートを1000rpmで1分間回転させた。その後、マイクロプレートを暗所で10分間インキュベートしてから、SpectraMax i3x マルチモードマイクロプレートリーダーで読み取った。
未知サンプルのDNAも96ウェルマイクロプレートおよび384ウェルのマイクロプレートの両方でアッセイし、SoftMax® Proソフトウェアで事前に設定したプロトコルを使用して濃度を算出しました。
図2. SpectraMax Quant AccuBlue Pico dsDNA標準曲線を384ウェルマイクロプレートで測定。log-logカーブフィット処理。R2 = 0.999. PMTゲインはAutoに設定し、10フラッシュ/リード。
結果
SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットの標準曲線は、384ウェルマイクロプレートでR2値＞0.99を示した（図1～3）。384ウェルプロトコルの検出下限（LLD）を表1に示す。図4では、96ウェルマイクロプレートおよび384ウェルのマイクロプレートの標準曲線を比較しており、どちらの曲線も同様の傾きを示した。これらの曲線を用いて未知dsDNAサンプル濃度を算出し、表2に報告した。
図3. SpectraMax Quant AccuClear Nano標準曲線を384ウェルマイクロプレートで測定。log-logカーブフィット処理。R2 =1.000. PMTゲインは10フラッシュ/リードでAutoに設定。
| SpectraMax Quant dsDNAアッセイキット | 計算されたLLD |
|---|---|
| Pico | 0.18 pg/µL |
| Nano | 0.002 ng/µL |
| Hi-Range | 0.200 ng/µL |
表1. 各dsDNA定量アッセイキットの検出下限（LLD）の計算値。
図4. 96ウェル法と384ウェル法の未知数での比較。log-logカーブフィット処理を両方のデータセットに適用した。96ウェル標準曲線を赤で、384ウェル標準曲線を緑で示す。どちらの標準曲線も R2 値 > 0.998 を示しました。
| 実際の濃度 | 96ウェルフォーマット | 384ウェルフォーマット | |
|---|---|---|---|
| 不明 1 | 3 pg/µL | 2.92 pg/µL | 2.78 pg/µL |
| 不明 2 | 30 pg/µL | 29.41 pg/µL | 27.59 pg/µL |
表2. 未知dsDNAの定量。SpectraMax Quant AccuBlue Picoキットを用いて、96ウェルまたは384ウェルのマイクロプレートで未知dsDNA濃度を定量し、比較した。
結論
SpectraMax Quant dsDNAアッセイキットを384ウェルフォーマットで使用すると、アッセイのスループットが向上し、96ウェルフォーマットに匹敵する検出範囲が示されました。384ウェルフォーマットでは、通常の4分の1のサンプルDNA量でdsDNAを定量することができます。
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