Application Note DNA定量用SpectraDrop™
Micro-Volumeマイクロプレートの 性能を
最大限に引き出します。

はじめに

Molecular Devices SpectraDrop™マイクロ-ボリュームマイクロプレートを使用すると、SpectraMax®マイクロプレートリーダーで1プレートあたり最大64サンプルを、わずか2 µLのサンプル量で読み取ることができます。SpectraDropマイクロプレートには、特別に設計されたアダプターとスライドベアが組み込まれており、光学的透明度により吸光度モードと蛍光モードの測定が可能で、ユーザーのアプリケーションニーズに対応します（図1）。SpectraDropマイクロプレートのスライドデザインは、キャリブレーションの必要性をなくし、5％以下のCVでウェル間の一貫した読み取り値を提供します。

SpectraDropマイクロプレートキットの構成は以下の通りです：

• SBS標準マイクロプレートアダプター
• 24ウェル低容量サンプルスライドまたは64ウェル低容量サンプルスライド
• 2µlサンプル用0.5mmパス長（透明スペーサー）カバースライド
• 1.0mmパス長（ブルースペーサー）4µlサンプル用カバースライド

UV吸光度を用いた核酸の定量法は、多くの種類のサンプルの定量を可能にする一般的な方法です。このような測定の性能を最適化するために重要なことは、サンプル中や光学表面上の汚染物質の存在に起因するバックグラウンドノイズを低減することです。このアプリケーションノートでは、簡単な日常的なお手入れとクリーニングによって性能を最大限に引き出す方法について説明します。

材料

• SpectraDropマイクロボリュームマイクロプレート
• リントフリーまたは低リントの使い捨てラボワイプ
• エアダスター（圧縮空気缶）
• 二本鎖DNA（Sigma P/N D1501-1Gなど）
• 脱イオン水またはTEバッファー
• 2µLまたは4µLのピペッティングが可能な8チャンネルピペッター
• 吸光度検出モード付きSpectraMaxマイクロプレートリーダー

洗浄方法

本文テキストSpectraDropスライドのクリーニング

SpectraDrop スライドの端を持ち、暗い背景で汚れやほこりを確認してください。パウダーフリーのラテックス製またはニトリル製の実験用手袋を着用すると、指紋や皮脂による汚れを最小限に抑えることができます。汚れやほこりが観察された場合は、使い捨てのウェットティッシュでスライドを拭いてください。水またはアルコールで湿らせた実験用ウェットティッシュで、付着しやすい汚れや指紋を取り除く。拭き取り布の代わりに、痕跡のない綿棒を使用することもできます。

ほとんどのサンプル測定では、使い捨ての実験用ワイパーでスライドを拭くだけで十分です。サンプル濃度が低いと予測される場合、またはバックグラウンドノイズを最小限に抑えたい場合は、以下の手順が重要になります。暗い背景でスライドを再検査し、ほこり粒子がないことを確認する。バックグラウンドノイズを最小限に抑えるため、缶入りエアダスターを使って目に見えるほこり粒子を取り除く。エアダスターは、スライドに付着したホコリを吹き飛ばすために、短時間で穏やかに使用する。長い時間または強い力で吹き飛ばすと、過冷却やスライド上の結露につながり、簡単に除去できない場合があります。SpectraDropスライドに静電気防止スプレーを使用することは推奨されません。

SpectraDropマイクロプレートでの測定に使用する緩衝液やその他の溶液は、バックグラウンド 値の上昇やサンプル間のばらつきの原因となる微粒子を最小限に抑えるため、フィルタリングする ことができます。

注：強酸や強アルカリの溶媒は、スライドマスクに損傷を与えるため、SpectraDropMicroVolume Microplateでは使用しないでください。

結果

DNAスタンダードカーブ

SpectraDrop マイクロボリュームマイクロプレートによるDNA検出の感度を実証するため、1.9～190 ng/µLの既知濃度のDNAスタンダードをTEバッファーで調製し、8チャンネルピペッターを使用して、TEバッファーブランクとともにSpectraDrop™マイクロボリュームマイクロプレートのウェル（スポット）に3または6反復セットでピペッティングしました。0.5mmスペーサー付きSpectraDropカバースライドを使用し、1スポットあたりの容量は2μLでした。

SpectraDrop プレートを SpectraMax M5eMicroplate リーダーで読み取り、SoftMax® Pro ソフトウェア（図2）でデータを解析し、プレーティングしました。上記のガイドラインに従ってスライドを洗浄した場合、バックグラウンドの標準偏差の3倍の計算に基づく2本鎖DNAの検出下限は2 ng/µL未満であった。

DNA定量

DNA濃度は、ランベルト・ベールの法則（A=x ξ c、Aは260 nmでの吸光度、ξはモル吸光度、lは光が通過する溶液の長さ、cは溶液の濃度）を用いて、260 nmでの吸光度測定値から直接計算することができる。TEバッファーに溶解した二本鎖DNAの場合、濃度係数（モル吸光度の逆数）は45である。SpectraDrop™Micro-Volumeマイクロプレートの光路長（l）は、カバースライドオプションの使用により、0.5 mmまたは1.0 mmとなります。

SoftMax® Proソフトウェアでは、SpectraDrop™Micro-Volumeマイクロプ レートを使用して読み取ったサンプルのDNA濃度の計算を簡略化するために、 あらかじめ設定されたプロトコルをご利用いただけます。使用するスライドスペーサーに対応する光路長が適用され、吸光度測定値から直接サンプル濃度を自動計算します（図3）。

結論

SpectraDropMicro-Volumeマイクロプレートの性能を最大限に引き出すための重要なファクターは、適切な洗浄です。SpectraDropマイクロプレートのスライドに付着したほこりや汚れを除去することで、バックグラウンド吸光度やサンプル間のばらつきを最小限に抑え、最適な感度と信頼性の高い結果を得ることができます。上記のようにスライドを注意深く洗浄すれば、感度仕様の2 ng/µLを超えることも可能です。2ng/µLをはるかに超えるサンプルを測定する多くのユーザーにとっては、SpectraDropスライドをリントフリーまたは低リントのラボ用ワイプできれいに拭くだけで十分です。

SpectraDrop™Micro-Volumeマイクロプレートは、精度を損なうことなく、少量のサンプルを高感度に測定することができます。SpectraDropマイクロプレートのスライドは扱いやすく、すべての光学面に手が届くので洗浄が容易です。スペーサーとスライドの設計により、ウェル間の均一性に優れているため、ウェル間のキャリブレーションは不要です。0.5mmまたは1.0mmスペーサー付きカバースライドと同様に、24ウェルおよび64ウェルサンプルスライドもあり、ユーザーのスループットとサンプル量のニーズに対応できます。SpectraDrop™Micro-Volumeマイクロプレートは、SpectraMax Paradigm®プラットフォームを含むすべてのSpectraMaxリーダー、およびStakMax®マイクロプレートスタッカーと互換性があります。

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