Application Note SpectraMax iD3マイクロプレートリーダーで
トリプトファン蛍光を測定

はじめに

タンパク質の固有蛍光は、芳香族アミノ酸であるトリプトファン、チロシン、フェニルアラニンによるものである。トリプトファンは270-280 nm付近で最大に励起され、水中では350 nm付近に発光ピークを持つため、タンパク質の発光を支配し、溶媒の偏光や局所環境に最も敏感である。タンパク質が変性したときに起こるトリプトファン残基の水への露出は、より長いEmission波長へのシフトをもたらす。このピーク発光のシフトを利用して、タンパク質のアンフォールディングをモニターすることができる。

ここでは、内在性トリプトファン蛍光を測定するアッセイ用のSpectraMax® iD3マルチモードマイクロプレートリーダーの性能を実証します。トリプトファンの標準曲線を用いて高感度を示し、リゾチーム変性アッセイを用いてピーク発光のシフトを示した。リゾチームには2つのトリプトファン残基が封入されており、UV光で励起されると蛍光を発する。リゾチームが変性すると、トリプトファンの発光ピークは約6-10 nmシフトする。このピークシフトは、ネイティブおよび変性リゾチームの蛍光スペクトルスキャンを行うことで測定できる。

SpectraMax iD3 リーダーは、トリプトファン本来の蛍光測定に必要な感度と Wavelength スキャン機能を備えています。さらに、SoftMax® Proソフトウェアは、Spectral Optimization Wizardにより、最適な励起および発光波長を自動的に特定します。エミッションピークのシフトも自動的に計算され、解析が効率化されます。

材料

• SpectraMax iD3マルチモードマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製、型番：ID3-STD）
• L-トリプトファン (Sigma cat. #T-0254)
• リゾチーム（Sigma cat.）
• グアニジン塩酸塩 (Sigma社、商品番号 G7294)
• 透明壁、UVクリアー96ウェルマイクロプレート (Greiner cat. #655801)
• リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH 7.4

方法

トリプトファンの100 µMからの2倍希釈系列を調製し、UVクリア96ウェルマイクロプレートに200 µL/ウェルでトリプリケートした。検出下限（LLD）を算出するためのブランクとして、PBSの6ウェルを使用した。SoftMax ProソフトウェアのSpectral Optimization Wizardを使用して、以下のことを行った。

方法

励起および発光波長は、SoftMax ProのSpectral Optimization Wizard（図1）を用いて最適化した。この機能により、シグナル対ノイズ比が最も良い波長の組み合わせを励起波長285 nm、発光波長345 nmとして特定した。SpectraMax iD3リーダーは、最適な波長の組み合わせを使用することで、検出下限9.5 nM、r2 > 0.99の優れた直線性を持つトリプトファン標準曲線を正確に測定することができた（図2）。ネイティブ対変性リゾチームサンプルのスペクトルスキャンでは、変性に伴う蛍光強度のわずかな増加とともに、発光ピークの350 nmから355.5 nmへのシフトが示された（図3）。この発光ピークのシフトは期待値に近い。

結論

SpectraMax iD3リーダーは、内在性トリプトファン蛍光を測定することにより、タンパク質の特性解析を可能にする。15 nmの励起帯域幅と25 nmの Emission帯域幅を使用することで、このリーダーは低nM範囲の非常に低濃度のトリプトファンを検出することができる。さらに、Spectral Optimization Wizard は、最適な励起および Emission Wavelength を自動的に特定する。

SoftMax Pro ソフトウェアのプロトコルを事前に設定することで、変性リゾチームのピーク波長とピーク波長シフトが自動的に特定されるため、分析時間を短縮できる。