Application Note SpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダーで
細胞溶解液中の総タンパク質を測定
- 最小限のインキュベーション時間でタンパク質濃度を正確に測定
- 8チャンネルリードヘッドで結果を素早く取得
- SoftMax Proソフトウェアの設定済みプロトコルを使用して、標準曲線をプロットし、サンプルのタンパク質濃度を自動的に計算します。
PDF版（英語）
はじめに
ジョイス・イタタニ｜アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラーデバイス
キャシー・オルセン博士｜Sr.アプリケーションサイエンティスト｜モレキュラー・デバイス
細胞溶解液からのタンパク質濃度の定量は、ウエスタンブロットや酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）など、多くのダウンストリームアプリケーションにとって重要なステップである。最もポピュラーな2つのアッセイは比色分析で、タンパク質の存在下での試薬の色の変化に依存する。ブラッドフォードタンパク質アッセイは、クマシーブルー色素の465nm（未結合）から595nm（結合）への吸光度シフトに基づいている。(1)タンパク質はCu2+をCu1+に還元し、(2)ビシンコニン酸はCu1+に結合し、562nmで光を強く吸収する紫色の複合体を形成する。
ここでは、細胞溶解液中の総タンパク質を定量するためのPierce Rapid Gold BCAアッセイとPierce Detergent Compatible Bradfordアッセイの使用法について説明します。標準的なBCAアッセイは37℃で30分のインキュベーションを必要とするが、Rapid Gold BCAアッセイは室温で5分のインキュベーションで済み、吸光度は480nmで測定される。洗剤適合ブラッドフォードアッセイは、洗剤を含むバッファーで溶解したセルにクマシー色素を使用した場合に発生する問題を克服しています。
どちらのアッセイもSpectraMax® ABS Plusマイクロプレートリーダーで読み取った。SoftMax® Proソフトウェアであらかじめ設定されたプロトコルを用いてデータを取得し、そこから細胞溶解液の濃度を決定する標準曲線をプロットした。Rapid Gold BCAアッセイとデタージェント適合ブラッドフォードアッセイのいずれも、使用した細胞溶解液で同様の結果が得られた。
材料
- Pierce Rapid Gold BCAタンパク質アッセイキット (ThermoFisher cat. #A53226)
- ピアス洗浄剤適合ブラッドフォードアッセイキット（サーモフィッシャー社製、商品番号23246）
- RIPA Buffer（ThermoFisher 社のカタログ番号 89900）
- ハルトプロテアーゼ阻害剤シングルユースカクテル（ThermoFisher cat.）
- グライナー透明96ウェルマイクロプレート（Greiner Bio-One cat.）
- CHO-K1セル（ATCC cat.）
- SpectraMax ABS Plusマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製、型番：ABS Plus）
SpectraMax ABSおよびSpectraMax PLUS 384マイクロプレートリーダーでも同様の結果が得られます。
方法
細胞溶解液の調整
CHO-K1細胞のT-75フラスコから培地を吸引し、細胞をカルシウムとマグネシウムを含む10mLの冷PBSで洗浄した。PBSを吸引した後、2mLのRIPA緩衝液をフラスコに加え、細胞を室温で5分間インキュベートして完全に溶解させた。Haltプロテアーゼ阻害剤を最終濃度1Xで細胞溶解液に加えた。細胞溶解液を分割し、1.5mLの微量遠心管2本に移し、14,000rpmで20分間遠心した。上清の1:3希釈系列をPBSで調製し、セルと溶解バッファー濃度の範囲でアッセイの性能をテストした。
標準曲線
両タンパク質アッセイとも、ウシ血清アルブミン（BSA）標準品を25μg/mLから2000μg/mLの範囲で、アッセイキットの説明書に従って調製した。
Rapid Gold BCAアッセイ
20μLのBSA標準液または細胞溶解液を96ウェルマイクロプレート（n = 3）の各ウェルにピペッティングし、続いて200μLの作業試薬（50:1試薬A:試薬B）を加えた。プレートを 30 秒間振とう機にかけて混合し、室温で 5 分間振とうせずにインキュベートした。SpectraMax ABS Plusリーダーで480nmの吸光度を読み取った。
洗浄剤対応ブラッドフォードアッセイ
10µLのBSA標準液または細胞溶解液を96ウェルマイクロプレート（n = 3）の各ウェルにピペッティングした。各ウェルに300μLのDetergent Compatibleブラッドフォード試薬を加えた。ウェルの内容物を上下に数回ピペッティングして混合した。プレートを室温で10分間インキュベートし、SpectraMax ABS Plusリーダーで595 nmで読み取った。
データ分析
標準曲線はSoftMax Proソフトウェアの2次曲線フィットを用いてプロットし、細胞溶解液の濃度はソフトウェアにより標準曲線から算出した。
結果
Rapid Gold BCA および Detergent Compatible Bradford アッセイ用の BSA 標準曲線を図 1 に示す。SoftMax Proソフトウェアは、各アッセイの標準曲線から細胞溶解液濃度を自動的に算出しました。
図1. BCA Rapid Goldアッセイ（赤プロット、r2 = 1.000）およびDetergent Compatibleブラッドフォードアッセイ（青プロット、r2 = 0.999）のBSA標準曲線。
| サンプル | ウェルズ | 希釈倍率 | OD値 | R | 濃度 | 平均濃度 | 標準偏差 | CV | 調整濃度 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 01 |
E1 F1 G1 |
1.000 |
0.355 0.996 0.403 |
239.916 692.080 272.547 |
401.514 | 252.166 | 62.8 | 401.514 | |
| 02 |
E2 F2 G2 |
3.000 |
0.395 0.356 0.322 |
266.970 240.998 218.043 |
242.004 | 24.479 | 10.1 | 726.011 | |
| 03 |
E3 F3 G3 |
9.000 |
0.151 0.124 0.116 |
103.796 85.800 80.931 |
90.176 | 12.004 | 13.4 | 811.580 | |
| 04 |
E4 F4 G4 |
27.000 |
0.044 0.039 0.030 |
33.386 30.517 24.327 |
29.410 | 4.630 | 15.7 | 794.073 |
平均調整結果：683.3 図2. Rapid Gold BCAアッセイの結果。SoftMax Proソフトウェアのデータテーブルは、連続希釈した細胞溶解液の計算濃度を示しています。
| サンプル | ウェルズ | 希釈倍率 | OD値 | R | 濃度 | 平均濃度 | 標準偏差 | CV | 調整濃度 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 01 |
E1 F1 G1 |
1.000 |
0.224 0.225 0.188 |
216.035 216.679 178.309 |
203.674 | 21.969 | 10.8 | 203.674 | |
| 02 |
E2 F2 G2 |
3.000 |
0.217 0.225 0.251 |
208.432 217.537 245.221 |
223.730 | 19.160 | 8.6 | 671.190 | |
| 03 |
E3 F3 G3 |
9.000 |
0.117 0.111 0.107 |
104.006 98.128 94.286 |
98.806 | 4.895 | 5.0 | 889.258 | |
| 04 |
E4 F4 G4 |
27.000 |
0.050 0.051 0.039 |
37.286 38.564 27.182 |
34.344 | 6.235 | 18.2 | 927.291 |
平均調整結果：672.9 図3. ブラッドフォードアッセイの結果。SoftMax® Proソフトウェアのデータテーブルは、Detergent Compatibleブラッドフォードアッセイによる細胞溶解液の計算濃度を示しています。
結論
Pierce Rapid Gold BCA および Pierce Detergent Compatible protein assay は、長時間のインキュベーションや溶解液中の洗剤の影響を気にすることなく、細胞溶解液サンプル中の総タンパク質を簡単に定量する方法を提供します。Rapid Gold BCAアッセイでは、より直線的な標準曲線が得られ、希釈した細胞溶解液の範囲にわたってより一貫した結果が得られますが、全体的な結果はどちらのキットも同様でした。
SoftMax Proソフトウェア搭載のSpectraMax ABS Plusリーダーは、標準曲線をプロットし、サンプル濃度を自動計算する設定済みプロトコルを備え、データ収集・解析のための完全なソリューションを提供します。Speed Read設定により、96ウェルプレートをわずか5秒で読み取ることができ、タンパク質の定量プロセスがさらに効率化される。
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