Application Note SpectraMaxマイクロプレートリーダーを用いた
CyQUANT細胞増殖アッセイによる細胞増殖の測定

はじめに

蛍光を用いた細胞増殖の定量により、細胞増殖に対する薬剤やその他の実験的処置の効果を容易にモニターすることができる。Life Technologies 社の CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit は、蛍光マイクロプレートリーダーを用いた高感度、迅速かつ簡便な細胞増殖定量法である。CyQUANT GR色素は細胞核酸に結合し、標準曲線から細胞数を算出することができる。DNA 対 RNA 比は細胞周期の過程で変化する可能性があるため、CyQUANT キットを使用すると、RNase 消化細胞溶解液と核酸標準曲線を用いて細胞数を測定することができます。

このアプリケーションノートでは、CyQUANTキットをMolecular DevicesのSpectraMax®マイクロプレートリーダーおよびSoftMax® Proソフトウェアと組み合わせて使用する方法について説明します。2つの方法について詳述する。一つ目は、細胞ベースの標準曲線を用いて細胞増殖を定量する方法である。もう一つは、RNase処理した細胞サンプルとDNA標準曲線を用いて細胞増殖を定量する方法です。

材料

• CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit（Life Technologies 社、カタログ番号 C7026）： コンポーネントA、400XのCyQUANT GR色素、コンポーネントB、20Xの細胞溶解バッファー、およびコンポーネントC、λ DNAスタンダード、100 µg/mL溶液100 µL。
  注意：Lysis Buffer と CyQUANT GR は希釈後数時間以内に使用すること。CyQUANT GR 溶液は必ず遮光する。
• セル 本アプリケーションノートのデータ作成にはCHO-K1細胞を使用した（ATCC # CCL-61）
• DNA 標準曲線を使用する場合は EDTA（Fisher Chemicals 社の Cat.# S311-100）
• DNA 標準曲線を使用する場合は NaCl（Fisher Chemicals 社の Cat. # S271-500）
• DNase フリーの RNase A または RNase カクテル（Ambion 社の Cat.# 2286）
• 黒色96ウェルクリアボトムマイクロプレート（Corning cat.# 3603）
• 蛍光検出モード付きSpectraMaxマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社製）

細胞の調製

接着細胞または非接着細胞は、CyQUANT アッセイ用に、アッセイするマイクロプレート内で直接増殖させ凍結させるか、培養容器内で増殖させた後、アッセイ用にマイクロプレートに移す細胞のペレットサンプルを凍結させることにより調製した。詳細は、Life Technologies 社の CyQUANT Cell Proliferation Assay 製品情報シート MP-7026 をご参照ください本文テキスト

細胞ベース標準曲線を用いたCyQUANTアッセイの実施方法

増殖アッセイする細胞を準備する

ステップ 1: 培養プレートからトリプシンまたは EDTA 溶液を用いて接着細胞を剥離し、培地を用いて細胞懸濁液を 96 ウェルマイクロプレートに希釈し、表 1 のテンプレートセットアップに示す細胞濃度（細胞数/ウェル）にする。細胞を含まない対照ウェルも用意する。

ステップ 2： マイクロプレートを 37℃で所望の時間インキュベートし、その後増殖を測定する。インキュベーション時間は、実施する増殖アッセイのタイプ、使用するセルタイプ、実験デザインによって異なります。

ステップ 3： ウェルから培地を静かに吸引する。ウェルはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で穏やかに洗浄してもよいが、これは必須ではなく、細胞が外れる可能性のある高密度の培養には推奨されない。

ステップ4：マイクロプレート内のセルを、アッセイ準備が整うまで-70℃で凍結する（最低1時間、最長4週間）。この凍結ステップにより、細胞サンプルの完全な溶解が保証されます。

標準曲線用の細胞の準備

注意：標準曲線用の細胞は、実験で使用したものと同じ種類を使用するのが最善です。

ステップ1：トリプシンまたはEDTA溶液を用いて培養プレートから接着細胞を剥離し、培養メデュームに濃縮細胞懸濁液を調製する。セルは105～106個/mL程度の密度にする。

ステップ2：細胞懸濁液1.0 mLを約200 x g（微量遠心機で約1500 rpm）で5分間遠心する。上清を捨て、細胞ペレットを-70℃で凍結する。この凍結工程により、セルが完全に溶解される。

アッセイ試薬の調製

ステップ 1: 濃縮細胞溶解バッファー原液を蒸留水で1:20に希釈し、1X細胞溶解バッファーとする。

ステップ 2: 濃縮 CyQUANT GR 原液を 1:400 に希釈し、1X 細胞溶解バッファーを調製する。この溶液はガラスではなくプラスチック容器に調製する（CyQUANT 製品添付文書参照）。

セルベース標準曲線および未知検体の調製

ステップ 1: 凍結しておいたセルペレットを室温で数分間解凍する。CyQUANT GR dye/cell-lysis buffer 1.0 mL を加え、短時間ボルテックスして細胞を再懸濁する。ペレットに106個の細胞が含まれていたと仮定すると、得られた細胞溶解液には106個/mL相当の細胞が含まれていることになります。

ステップ2：マイクロプレートのウェルに希釈系列を作り、50,000細胞/ウェルから開始し、24細胞/ウェルまで1：2希釈系列を作る。CyQUANT GR dye/cell-lysis buffer を使用し、目的の細胞数が 200 µl の容量になるように希釈する。各標準を4レプリケート調製し、コントロールとして細胞無しのレプリケートを1セット含む（マイクロプレートに余裕を持たせるため、標準細胞の1つ（例：781 cells/well）を省略することができる）。

ステップ3：マイクロプレートを遮光し、室温で2～5分間インキュベートする。

インストゥルメンテーションとソフトウェアのセットアップ

ステップ1：マイクロプレートリーダーの電源を入れます。SoftMax Proソフトウェアを起動し、Protocol LibraryのCell Growth & ViabilityフォルダーにあるCyQUANT Fluorescenceプロトコルを開きます。

ステップ2：表2に示すインストゥルメンテーション設定を使用します。これらの設定は、設定済みプロトコールですでに選択されています。

ステップ3：プロトコールの細胞標準セクションにある Template Editor を使用して、マイクロプレート内の標準品（各希釈の細胞番号）、ブランク（細胞溶解液なし）、未知物質の位置を示すアッセイのテンプレートを作成する。標準品と未知検体のテンプレートの例を図1に示す。CtrlキーとShiftキーを同時に押したときに表示されるテンプレートセットアップウィンドウで、各ウェルに割り当てられた値が表示されていることに注意してください。未知検体の割り当て名（Un01-Un12）はこのビューには表示されません。

ステップ4：マイクロプレートをマイクロプレートリーダーにセットします。ご使用のマイクロプレートリーダーでトップリード用のアダプターが必要な場合（SpectraMax M5など）は、プレートキャリッジにアダプターをセットします。

ステップ5：ソフトウェアのReadボタンをクリックします。インストゥルメンテーションがプレートを読み取り、SoftMax ProソフトウェアのPlateセクションに相対蛍光単位（RFU）が表示されます。

データの分析

ステップ1： マイクロプレートの読み取りが完了すると、テンプレート設定時に自動的に作成されたGroup tableでデータが解析されます。

ステップ2： Template EditorのStandardsグループにウェルが割り当てられていれば、ソフトウェアによって標準曲線が自動的にプロットされます。グラフセクションのドロップダウンカーブフィットメニューから適切なカーブフィット処理を選択します。このアプリケーションノートで標準曲線をプロットする際、log-logカーブフィットを使用しました（図2）。二次曲線フィットも適しているかもしれません。

ステップ3：実験細胞サンプル（未知）のウェルあたりのセル数を決定する。SoftMax Pro CyQUANTアッセイプロトコルでは、細胞ベース標準曲線からこれらの値を算出し、UnknownsグループセクションのConcentration列に記載します。

セルベース標準曲線の結果

上記のように設定したセルベースの標準曲線を図 2 に示す。標準曲線をアッセイの全ダイナミックレンジにわたってグラフ化する際、log-logカーブフィットを使用しました。結果はSpectraMax M5マイクロプレートリーダーによるものですが、蛍光検出モードを備えた他のMolecular Devicesマイクロプレートリーダーでも同様の結果が得られます（データは示していません）。

表3は、表1のスキームに従ってプレーティングし、2日間培養で増殖させたCHO-K1細胞の細胞増殖アッセイ結果のサンプルである。2日目のセル/ウェルは、細胞ベースの標準曲線を用いてSoftMax Proで算出した。

DNAベースの標準曲線とRNase処理細胞を用いたCyQUANTアッセイの実施方法

細胞増殖は、DNA標準曲線を用いてDNA含量に基づいてアッセイすることもできる。標準曲線は、RNA が蛍光シグナルに寄与しないように細胞溶解液を DNase フリー RNase で前処理すれば、細胞 DNA を定量することができる。このアプリケーションノートでは、DNA スタンダードカーブの設定方法と RNase 処理した細胞サンプルについて説明します。

アッセイ試薬の準備

ステップ 1: 濃縮細胞溶解バッファー原液を蒸留水で1:20に希釈し（1ウェルあたり200 µL調製）、1X溶解バッファー溶液を調製する。最終濃度が1mM EDTAと180mM NaClのものと、EDTAやNaClを含まないものの2種類の1X溶解バッファーを用意する。

ステップ 2: 濃縮 CyQUANT GR 原液をそれぞれ 1:400 または 1:200 に希釈し、CyQUANT GR 色素/細胞溶解バッファー の 1X および 2X 作業溶液（各ウェルあたり 100 µL）を作製する。この溶液は、Life Technologies 社が推奨するように、ガラス製ではなくプラスチック製の容器で調製する。

プラスチックチューブでDNAスタンダードを調製

ステップ 1: キットの 100 µg/mL DNA スタンダードを 1X CyQUANT GR dye/cell lysis buffer で希釈し、1 µg/mL のストック溶液を調製する。

ステップ 2: 1 µg/mL 原液をさらに希釈し、表 4 に示す希釈系列を作成する。

注：CyQUANTキットにはλバクテリオファージDNAスタンダードが含まれています。このアプリケーションノートに示されたデータは、連続希釈で調製したこの標準物質を用いて作成されたものです。実施するアッセイによっては、キットの DNA スタンダード、または製品情報シート MP-7026 の指示に従って調製したサンプルに適した別の DNA を使用することをお勧めします。

細胞の準備

Life Technologies 社の CyQUANT 製品情報シートから、細胞の種類（接着細胞または非接 着細胞）および培養条件（マイクロプレートまたは培養容器）に応じて、適切な 培養・凍結手順書を選択する。細胞を-70℃で凍結する。このアプリケーションノートでは、接着細胞をトリプシン処理して培養容器から剥離し、ペレット化して凍結した。アッセイ性能を示すために、既知数の細胞を封じ込めたサンプルを使用した。

細胞サンプル、DNAスタンダードカーブ、ブランクの準備

ステップ1：事前に準備した凍結細胞ペレット（またはマイクロプレート）を-70℃保存から取り出す。凍結細胞を室温で数分間解凍する。

ステップ2：180mMのNaClと1mMのEDTAを封じ込めた100μLの1X細胞溶解バッファー を各ウェルと細胞のない4ウェル（ブランク）に加え、細胞をRNaseで前処理する。ペレット化したセルを使用する場合は、各サンプルを100µLに再懸濁し、マイクロプレートのウェルに移します。細胞を封じ込めた各ウエルと、細胞を封じ込めなかったコントロールのウエルに、4µLのRNase（各ウエルに2ユニット、下記注参照）を加える。室温で1時間インキュベートする。

注意：DNaseフリーのRNaseは、サンプル処理に必要な全ユニット数が10 µL以下になるような濃度で使用する。例えば、Ambion 社の RNase Cocktail は 500 U/mL の活性を持つので、1 ウェルあたり 4 µL で 2 ユニットとなります。

ステップ 3: 2X CyQUANT GR dye/cell-lysis buffer を、細胞のないコントロールウェルも含め、各マイクロプレートウェルに 100 µL ずつ加える。

ステップ 4: DNA 標準曲線を作成するために、あらかじめ調製しておいた DNA 連続希釈液を、テンプレートエディターで定義したマイクロプレートの適切なウェルに移します。プレートには2つのコントロールを封入する。細胞サンプルと同じ手順で調製した、細胞を含まない（DNAを含まない）消化コントロールと、200µLの1X CyQUANT GR色素/細胞溶解緩衝液のみを含む（DNAおよびRNaseを含まない）標準曲線コントロール/プレートブランクである。

ステップ5：サンプルを2～5分間インキュベートする。

インストゥルメンテーションとソフトウェアのセットアップ

ステップ1：マイクロプレートリーダーの電源を入れます。SoftMax Proソフトウェアを起動し、Protocol LibraryのCell Growth & ViabilityフォルダーにあるCyQUANT Fluorescenceプロトコルを開きます。

ステップ2：表2に示すインストゥルメンテーション設定を使用します。これらの設定は、設定済みプロトコールですでに選択されています。

ステップ3：プロトコルのDNAスタンダードセクションにあるTemplate Editorを使用して、マイクロプレート上のスタンダード、未知細胞（RNaseで処理した細胞）、プレートブランクの位置を示すアッセイのテンプレートを作成する。

プレートの読み取りとデータ解析

ステップ1：マイクロプレートをリーダーにセットする。

ステップ2：プレートを読み取る。

ステップ 3: マイクロプレートの読み取り後、RFUがPlateセクションに表示されます。データは、テンプレートのセットアップ中に作成したグループテーブルで分析されます。

ステップ4： Template Editorでウェルが適切なグループに割り当てられていれば、DNAスタンダードカーブが自動的にプロットされます。

ステップ5：GraphセクションのCurve Fitメニューから適切なカーブフィット処理を選択します。この実験ではlog-logカーブフィットを使用しました。

ステップ6： DNA標準曲線から細胞DNA濃度が自動的に補間され、Unknownsグループの表に表示されます。

DNAスタンダード曲線の結果

典型的な DNA ベースの標準曲線を図 3 に示します。これらのデータの作成にはSpectraMax M5マイクロプレートリーダーを使用しましたが、蛍光検出モードを備えた他のMolecular Devices製リーダーでも同様の結果が得られます（データは示していません）。DNAスタンダードカーブからRNas処理細胞の細胞DNA濃度を算出した例を表5に示す。このアプリケーションノートでは、未知細胞として連続細胞希釈液を用いた。実際には、50～50,000セル/ウェル（標準曲線の直線範囲内）であれば、どのような細胞数でも検出可能であり、この方法を用いて細胞DNA値を求めることができる。

図4は、細胞数/ウェルに対する各サンプルセットの平均細胞DNAを示す。これらの条件下でのアッセイの直線範囲は、製品情報シート MP 7026 に基づく予想通り、50～50,000 セルです。RNase 処理した細胞サンプルと未処理の細胞サンプルの RFU の比較を図 5 に示し、RNase 処理により細胞溶解液中の蛍光量が減少することを示している。

結論

CyQUANT Cell Proliferation Assay は、細胞数または細胞 DNA 含量を定量するための迅速で高感度な蛍光法である。アッセイ結果は、SpectraMax M5または蛍光検出モードを備えた他のMolecular Devicesリーダーでも同様である。細胞ベースの標準曲線を用い、5分間のインキュベーションを行ったところ、CyQUANT製品情報シートに記載されているのと同様の検出限界とダイナミックレンジが確認された（サンプルあたり50～50,000細胞）。キットに付属のλ DNAスタンダードで作成したDNA標準曲線を用いると、わずか50細胞中のDNA量を算出することができた。SoftMax Proソフトウェアの解析機能と、あらかじめ設定されたCyQUANTプロトコルを使用することで、データの計算と報告を簡便に行うことができます。

参考文献

Life Technologies 製品情報シート MP 7026 1/12/01: CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (C-7026).

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